三種抗生素替代物的研究進(jìn)展

周芷錦 穆 琳

浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，杭州310020

1929年英國科學(xué)家在培養(yǎng)細(xì)菌時無意中發(fā)現(xiàn)了青霉素的存在，自此抗生素出現(xiàn)在人類歷史上，幫助人類和動物戰(zhàn)勝了很多疾病。20 世紀(jì)50年代前后，抗生素促進(jìn)動物生長和預(yù)防疾病的作用在養(yǎng)殖中被發(fā)現(xiàn)，自此抗生素作為促生長劑在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用。據(jù)Thomas 等[1]估計，2010年全球每年生產(chǎn)牛、雞、豬產(chǎn)品所消耗抗生素的用量為45 mg/kg，148 mg/kg 和172 mg/kg，到2030年，這一數(shù)據(jù)將會增加67%。而在我國，據(jù)中科院公布的數(shù)據(jù)，2013年我國的抗生素總使用量為16.2 萬t，居世界第一，遠(yuǎn)超第二位的美國，其中獸用抗生素占52%?？股氐氖褂脴O大提高了人類生存率和養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效能，但其大量使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的問題日趨嚴(yán)重，已成為威脅公共衛(wèi)生的國際問題。為了遏制耐藥性進(jìn)一步發(fā)展，結(jié)合抗生素使用分布現(xiàn)實，獸用抗生素的減量化，特別是抗生素促生長劑的減量化甚至禁用成為了必然。1986年瑞典率先禁用了抗生素促生劑，隨后歐盟各國開始對抗生素促生長劑進(jìn)行不同程度的限制[2]，到2006年1月1日歐盟撤銷了所有抗生素的促生長用途。面對我國細(xì)菌耐藥性的問題，特別是我國動物源細(xì)菌耐藥性的不斷發(fā)展，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194 號公告，到2020年年底前，我國將退出除中藥外的所有促生長藥物飼料添加劑。根據(jù)丹麥的國家豬生產(chǎn)委員會（NCPP）的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，促生長藥物飼料添加劑禁用后，豬體內(nèi)的潛在病原菌出現(xiàn)耐藥性的概率的確下降了，但豬的生產(chǎn)性能在不同生長階段同樣出現(xiàn)不同程度的下降，對于斷奶仔豬的影響較大，生產(chǎn)速率下降了18 g/d，斷奶后死亡率也較禁用前提高0.6%，同時腹瀉和感染其他疾病的發(fā)生率也有明顯提高[2]。在這一形勢下，為了促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康高效有序的發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)中抗生素替代物的研究，包括微生態(tài)制劑、中草藥等成為了研究熱點。

1 微生態(tài)制劑（益生菌）替代抗生素的研究

微生態(tài)制劑，又叫活菌制劑、益生素、益生菌等，最早在1974年由Parker 提出與“抗生素”相對的新概念[3]，1989年Fuller[4]對微生態(tài)制劑做了具體的定義，定義微生態(tài)制劑是一類能夠促進(jìn)腸道內(nèi)微生物平衡，對宿主產(chǎn)生有益作用的活的微生物添加劑。1994年在德國召開的國際會議上，對微生態(tài)制劑的定義進(jìn)一步完善，定義微生態(tài)制劑是指含活菌或死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細(xì)菌制品，經(jīng)口或其他黏膜途徑投入，旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制[5]。國外早在20 世紀(jì)20年代就開始研究微生態(tài)制劑。目前，美國允許直接飼喂動物的微生物制劑有43 種，包括嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌等。日本主要采用枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、乳酸桿菌等作為微生態(tài)制劑。我國微生態(tài)制劑的研究起步于20 世紀(jì)70年代[6]。經(jīng)過不斷地發(fā)展和增補(bǔ)，2013年底我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了2045 號公告（飼料添加劑品種目錄（2013）），按照該目錄我國目前可用的微生物添加劑一共有34 種，包括地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、釀酒酵母等[7]。在使用量上，20 世紀(jì)70年代，美國微生態(tài)制劑的年產(chǎn)量已在8 000 t 以上。近年來已經(jīng)達(dá)到約5萬t/年。我國這方面發(fā)展較晚，但2010年微生態(tài)制劑也達(dá)到4 萬t[8]。

1.1 微生態(tài)制劑的促生長、提高生產(chǎn)性能作用研究

動物的胃腸道是一個微生態(tài)系統(tǒng)，本身存在大量的微生物，形成一個動態(tài)平衡。微生態(tài)制劑的活菌作為腸道的有益菌，在進(jìn)入腸道后，增加了腸道有益菌總量，與腸道內(nèi)源的有益菌形成優(yōu)勢菌群，改善腸道壞境，如調(diào)節(jié)腸道pH 值，維持腸道厭氧環(huán)境等，對動物消化道系統(tǒng)的發(fā)育和生理功能、免疫器官的發(fā)育等產(chǎn)生重要影響，同時對動物的應(yīng)激反應(yīng)起到一定的緩和作用。李雪莉等[9]設(shè)計以對照組、抗生素組和微生態(tài)制劑組來研究植物乳桿菌為主的微生態(tài)制劑對斷奶仔豬的生長性能、器官的重量和胃腸道發(fā)育的影響，試驗結(jié)果表明：在生產(chǎn)性能上，微生態(tài)制劑可顯著提高斷奶仔豬平均日增重和平均日采食量，降低料重比；在器官重量上，微生態(tài)制劑顯著提高斷奶仔豬脾臟相對重量，對胃、十二指腸、肝臟等器官的重量也有增加的趨勢；在腸道形態(tài)發(fā)育上，顯著增加斷奶仔豬十二指腸絨毛高度，顯著降低十二指腸、空腸、回腸絨隱比。該試驗同樣表明抗生素組與微生態(tài)制劑組在促生長和提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能上無顯著差異。鐘光等[10]通過對雄性肉仔雞注射地塞米松應(yīng)激，研究微生態(tài)制劑對其生產(chǎn)性能和腸道健康影響。研究發(fā)現(xiàn)：應(yīng)激能破壞腸道微環(huán)境，降低生產(chǎn)性能，抑制免疫器官發(fā)育；微生態(tài)制劑能使死淘率顯著降低，29日齡胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)分別提高14.29%、16.67%和20.00%，29日腸道絨毛高度增加33.3%，微生態(tài)制劑能顯著緩解應(yīng)激對腸道絨毛的損傷。另外有益菌定植在腸道內(nèi)，其代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)維生素、產(chǎn)氨基酸等影響腸道內(nèi)容物化學(xué)成分組成，影響或參與動物體內(nèi)的代謝途徑，其自身會分泌產(chǎn)生包括蛋白酶在內(nèi)的各種消化酶，有利于提高動物的采食效率，蛋白的轉(zhuǎn)化率等，提高動物的生產(chǎn)性能。崔闖飛等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)蛋后期的蛋雞飼糧中添加8×109cfu/g 的枯草芽孢桿菌時，顯著降低了平均日采食量和料蛋比；顯著增加了蛋殼厚度、強(qiáng)度和殼重比，顯著降低了破、軟蛋率，增加了蛋殼中鈣含量，但對產(chǎn)蛋率和平均蛋重?zé)o顯著影響。王曉峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在海蘭褐蛋雞的飼糧中添加0.05%以枯草芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑，蛋雞的產(chǎn)蛋率提高10.2%，降低了料蛋比和不合格蛋率，提升了A 級蛋的比例，從49.54%到59.35%。張進(jìn)紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在荷斯坦奶牛飼料中按1.0 g/kg 比例添加乳酸菌、芽孢桿菌等組成的復(fù)合微生態(tài)制劑，平均日產(chǎn)奶量提高1.9 kg，降低料奶比，改善奶牛泌乳性能；乳脂率提高0.18%，乳蛋白率提高0.16%，顯著改善奶牛的乳品質(zhì)。

1.2 微生態(tài)制劑的預(yù)防疾病作用研究

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大量使用除了用于治療具體動物疾病以外，另一個重要原因是長期低劑量的飼喂抗生素可以預(yù)防疫病的發(fā)生，降低養(yǎng)殖損耗率。微生態(tài)制劑如要代替抗生素在飼料中大量添加使用，則同樣需要有保護(hù)動物健康，減低疫病發(fā)生概率的作用。目前關(guān)于微生態(tài)制劑預(yù)防疾病，起健康保護(hù)作用的表現(xiàn)主要包括保護(hù)腸道上皮細(xì)胞和加強(qiáng)上皮細(xì)胞間緊密度的機(jī)械屏障；對腸道黏膜占位保護(hù)，分泌有機(jī)酸等抑制致病菌的生物屏障；改善上皮細(xì)胞免疫功能和調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的免疫屏障；產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和酶形成的化學(xué)屏障[14]。魏銀萍等[15]研究比較了嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌和糞腸球菌在致病菌對HT-29 細(xì)胞和粘蛋白粘附作用方面的抑制效果，試驗證明：三者分別可使致病性大腸桿菌粘附率由6.7%下降到2.85%，0.214%，1.9%；使傷寒沙門氏菌粘附率由32.49%下降到16.95%，12.93%，20.33%，具有較好的抑制作用。張丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌S62—9 利用其自身的營養(yǎng)競爭機(jī)制和產(chǎn)生抗菌肽的拮抗作用，對試驗的27 株細(xì)菌中大多數(shù)致病性細(xì)菌及部分真菌產(chǎn)生抑菌作用。對革蘭氏陽性菌的效果好于革蘭氏陰性菌，尤其對致病性金黃色葡萄球菌、鏈球菌、單增李斯特氏菌的抑菌效果最明顯。Baron 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30 能夠提高T 細(xì)胞中腫瘤壞死因子的含量，可用來防治腺病毒和甲型流感病毒等特定病毒感染。目前微生態(tài)制劑已經(jīng)應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，在預(yù)防疾病，提高動物機(jī)體免疫力方面有一定的成效。陳西風(fēng)等[18]對金霉素和復(fù)合微生態(tài)制劑對肉仔雞腸道菌群和免疫功能影響的研究發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑可顯著增加胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、IgA 含量和IgG 含量，顯著降低腸道內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)，當(dāng)添加量在0.1%、0.2%時，與添加量0.05%金霉素比較，效果更優(yōu)于金霉素。薛俊龍等[19]對1～5日齡的雛雞飼喂微生態(tài)制劑，在6日齡進(jìn)行雞白痢沙門氏菌攻毒實驗，微生態(tài)制劑的保護(hù)率為94%，攻毒對照組保護(hù)率為76%，早期雛雞飼喂微生態(tài)制劑能有效預(yù)防雞白痢。

1.3 微生態(tài)制劑替代抗生素存在的問題與展望

目前研究中微生態(tài)制劑存在的問題與研究方向：有益菌菌種的選擇：目前可應(yīng)用于生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌株很多，菌株的抑菌效果也屢見報道[15-17]，但菌株進(jìn)入腸道的定植效果仍需進(jìn)一步研究，有些菌株在進(jìn)入腸道后因為腸道本身的環(huán)境并不能形成優(yōu)勢菌群，怎么選擇培育優(yōu)勢菌種是微生態(tài)制劑生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有效活菌數(shù)的保持：微生態(tài)制劑要起到良好的效果需要達(dá)到一定的活菌數(shù)[20]。影響活菌數(shù)主要包括了2 個方面：一方面日前有報道不同的生產(chǎn)工藝對活菌存活率有很大影響[21]，怎樣改進(jìn)生產(chǎn)工藝是微生態(tài)制劑廠家未來研究的重點；另一方面活菌制劑從出廠到養(yǎng)殖場的運(yùn)輸過程以及在養(yǎng)殖場保藏期間怎么做到活菌數(shù)的保持，活菌制劑在使用時是否還具有有效性的相關(guān)研究還較少。此外，活菌制劑在與抗生素同時使用后是否還能保持腸道內(nèi)的益生菌數(shù)量也需要進(jìn)一步研究?；罹苿┑哪退幮裕夯罹苿┍旧硎抢糜幸婢趧游锬c道內(nèi)與致病菌競爭，以達(dá)到抑制致病菌的作用，從而替代抗生素使用，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。但活菌制劑中的菌株，如糞腸球菌等，是否會與耐藥菌株發(fā)生耐藥基因的傳遞，反而增加耐藥菌株是未來需要研究的問題。

2 中藥替代抗生素的研究

中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的寶貴財富，相比抗生素，中藥有副作用相對較小，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，同時中藥也可以很好地避免養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物應(yīng)用導(dǎo)致動物產(chǎn)品藥物殘留的問題。隨著抗生素耐藥性問題的發(fā)生，社會對無抗動物產(chǎn)品的呼聲不斷提高，養(yǎng)殖業(yè)的抗生素使用量必將大幅度降低。在這個背景下，中藥作為我國的傳統(tǒng)藥物，其在養(yǎng)殖業(yè)中抗生素替代物的研究以及應(yīng)用上可發(fā)揮的作用更為值得關(guān)注。近年來，我國的中獸藥整體規(guī)模在不斷擴(kuò)大，2016年我國中獸藥生產(chǎn)企業(yè)有1 313家，實現(xiàn)總產(chǎn)值45.45 億元，占化藥企業(yè)總產(chǎn)值的12.80%，是2008年的近3 倍。中獸藥的劑型包括有散劑、片劑、注射劑、顆粒劑和合劑（含口服液）。除此之外，中獸藥在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用還有作為飼料添加劑、中藥提取物等[22]。隨著醫(yī)藥生產(chǎn)工藝的不斷進(jìn)步，還出現(xiàn)了中藥超微粉[23]等新中獸藥產(chǎn)品。

2.1 中藥對提高動物生長性能作用的研究

各項研究證明，中藥作為飼料添加劑添加到飼喂日糧中可以顯著提高畜禽的生長性能，包括提高日增重、日采食量、降低其料重比，效果與抗生素相當(dāng)[24-25]?？梢蕴岣唢暳橡B(yǎng)分的消化率，李麗等[26]對比了金霉素組和中藥組（黃芪、陳皮、蒼術(shù)等）與對照組對飼料養(yǎng)分的消化率，2 組粗蛋白、粗纖維、粗脂肪的表觀消化率分別比對照組提高了4.43%、10.27%、5.36% 和4.65%、8.82%、4.86%，中藥組與金霉素組的效果無顯著差異。此外，中藥對于畜禽的應(yīng)激反應(yīng)有很好的緩解保護(hù)作用。武果桃等[27]研究發(fā)現(xiàn)，以刺五加、黃芪、元胡、黨參、五味子、山楂、甘草等藥物按一定比例組方的中藥可以使高溫應(yīng)激雞的肝臟中HSP70 mRNA 表達(dá)顯著增加，HSP70熱休克蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成，可以抵抗應(yīng)激造成的組織細(xì)胞損傷，提高機(jī)體熱耐受水平，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用。

目前，對于中藥促生長的機(jī)制研究相對較少，主要包括中藥對腸道健康保護(hù)作用，提高機(jī)體抗氧化能力的作用，對血清激素水平的作用等。張偉等[28]通過研究豬血清中抗氧化酶活性、丙二醛和腸道菌群變化以探索中藥對豬促生長的機(jī)制，結(jié)果表明添加中藥飼喂后豬血清中還原性谷胱甘肽過氧化物酶的活性顯著提高，丙二醛的含量顯著降低，并顯著改善豬腸道的微生物多樣性，提高了有益菌，特別是乳酸菌的豐度比例。胡丹等[29]研究同樣證明了中藥能提高肥育豬的總抗氧化能力，顯著降低血清中的丙二醛濃度，90日齡、110日齡、130日齡較對照組血清MDA 濃度分別降低了35.2%、39.4%、37.0%?；魰⒌萚30]以肉仔雞為實驗對象，研究中藥對血清中激素水平的影響。研究表明：中藥使促進(jìn)器官組織分化的甲狀腺素T3、T4 的水平顯著提高，且T3、T4 水平高的中藥組增重速度也較快；中藥組血清中GH 的水平顯著低于對照組，與生長速率成反比。另外該研究發(fā)現(xiàn)中藥組的尿酸、尿素氮水平顯著低于對照組，證明了中藥可以改善蛋白質(zhì)的代謝情況，促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸收、代謝和沉積。

2.2 中藥抗菌作用的研究

1）中藥抑菌作用。中藥作為傳統(tǒng)藥物，其抗菌作用得到廣泛的認(rèn)可，研究發(fā)現(xiàn)，中藥的抗菌作用主要來源其生物活性成分，目前認(rèn)為中藥的抗菌活性成分包括黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、多糖類、皂苷類、蒽醌類、萜類等[31]。從中藥的抑菌機(jī)制來分，主要包括破壞細(xì)菌的生物被膜改變細(xì)胞的通透性、抑制菌體內(nèi)酶的活性、影響細(xì)菌蛋白質(zhì)核酸的合成以及提高機(jī)體的免疫作用[32]。從中藥制劑來看，中藥有單方和復(fù)方之分，在抑菌作用上不只是某一種有效成分，還存在多種成分協(xié)同作用的效果。李美發(fā)等[33]通過研究黃芪、何首烏、黃連、金銀花、大黃、白頭翁、五倍子、葛根等8 種中草藥的提取液對豬腸道大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用來探究中藥組方對抑菌效果的影響。實驗結(jié)果表明：單方添加黃連、金銀花和五倍子對大腸桿菌抑菌效果較好；單方添加黃芪、黃連和大黃對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好；單方添加黃連和大黃對沙門氏菌抑菌效果較好。復(fù)方添加以黃芪0.25 mg/mL+黃連0.5 mg/mL+大黃0.25 mg/mL 體外抑菌效果最好，對3 種菌均有抑制作用。智曉艷等[34]研究發(fā)現(xiàn)黃連、黃芩、丹參和連翹對鏈球菌具有較好抑菌作用，最小抑菌濃度（MIC 值） 分別為32.0、32.0、16.0 和125.0 g/L，最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC值）分別為32.0、64.0、32.0 和125.0 g/L，以其為主藥組成的復(fù)方呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用。

2)中藥的耐藥性消除作用。研究發(fā)現(xiàn)，中藥除了本身具有抑菌作用外，對耐藥菌株的耐藥性也具有一定的消除作用。韋嬪等[35]對豬源致病性大腸桿菌的抑菌效果以及對慶大霉素耐藥性消除情況的研究表明除魚腥草外，黃連、金銀花、艾葉、五倍子表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，五倍子的抑菌效果最好；對慶大霉素耐藥性消除方面，黃連、金銀花、艾葉和五倍子均能消除致病性大腸桿菌對慶大霉素的耐藥性，其中五倍子對菌株耐藥性的平均消除率最高，作用24 h 后，平均消除率為12.53%，其最高消除率可達(dá)22.33%；作用48 h 后其平均消除率為13.68%，最高消除率可達(dá)24.4l%。中藥消除耐藥性的機(jī)制主要有以下幾個方面：消除耐藥R 質(zhì)粒、抑制耐藥菌的抗生素主動外排泵機(jī)制、抑制耐藥基因的表達(dá)。郭威等[36]研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM 轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制作用使其可恢復(fù)部分抗菌藥物的敏感性，實驗證明頭孢他啶、頭孢匹羅、左氧氟沙星、美羅培南對PAO1、Mex1、Mex2、Mex3 株菌的最小抑菌濃度（MIC 值）分別降低50%、75%、75%和50%～75%。蔣加進(jìn)等[37]以煎煮法制備的黃連提取液，進(jìn)行了耐藥質(zhì)粒(R 質(zhì)粒)消除試驗，結(jié)果表明，黃連提取液對雞源多重耐藥大腸桿菌耐藥性有一定的消除作用，其消除率跟作用時間有一定關(guān)系，24 h 和48 h 的耐藥性消除率分別達(dá)到4.5%和13.25%。任玲玲等[38]研究發(fā)現(xiàn)連翹作用后多重耐藥大腸埃希菌編碼主動外排泵系統(tǒng)的AcrA 基因發(fā)生了24 個堿基突變，改變了AcrA 基因的編碼序列，從而有效抑制多重耐藥大腸埃希茵的生長，減弱其耐藥性。

2.3 中藥替代抗生素存在的問題與展望

根據(jù)目前的研究報道，中藥在替代抗生素應(yīng)用中存在的問題：中藥成分不明確在應(yīng)用上講究的是君臣佐使的配伍，復(fù)方藥劑的效果往往好于單一藥劑[33-34]。目前研究中從中藥提取到了一部分具有抑菌作用的活性成分，如黃酮類，但對于藥材中其他成分在抗菌治療中的效果不明確，對復(fù)方藥劑成分的相互作用不明確，對成分是否有毒副作用不明確。中藥提取方式對抑菌效果的影響：中藥提取方式包括了干燥，粉碎，醇提，超聲等。據(jù)報道，不同的提取方式對抑菌效果影響極大，單一的提取方式的抑菌效果不如多方式結(jié)合的抑菌效果，甚至?xí)贸鱿喾吹慕Y(jié)果[33,39-40]。另外，目前研究報道的中藥抑菌作用的研究對象基本為中藥的提取物，對于直接使用中藥材添加到養(yǎng)殖動物的飼糧中能否起到抑菌作用尚不明確。中藥抑菌作用研究大多還局限在體外試驗，對于中藥在動物體內(nèi)作用的研究還比較少?；谏鲜鲈颍兴幰娲股卦陴B(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用還不成熟，中藥的抑菌作用還需進(jìn)一步研究，特別是中藥如何在動物體內(nèi)達(dá)到體外試驗效果的研究還需大量的試驗證明。

3 噬菌體替代抗生素的研究

噬菌體是一類廣泛存在于自然界中，能感染細(xì)菌、真菌類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。1915年英國微生物學(xué)家Twort[41]首次報道了其在葡萄球菌培養(yǎng)物的濾液中發(fā)現(xiàn)了可裂解葡萄球菌的物質(zhì)，觀察到了清晰的裂菌斑。隨后，1917年法籍加拿大微生物學(xué)家D′HerelletS[42]正式提出了“噬菌體”這一概念。噬菌體自發(fā)現(xiàn)就被應(yīng)用于人體治療包括痢疾、霍亂等由細(xì)菌感染造成的疾病[43]。20世紀(jì)70、80年代，Smith 等[44]經(jīng)過大量實驗研究報道了噬菌體對小牛、仔豬和羊羔大腸桿菌感染的治療作用。研究表明噬菌體可以顯著減少腸道內(nèi)致病性大腸桿菌的數(shù)量，有效防治大腸桿菌感染導(dǎo)致的腹瀉，降低死亡率。但隨著抗生素時代的到來，抗生素大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和其廣譜的抗菌效果，成為了時代的主導(dǎo)，關(guān)于噬菌體的研究逐步停滯。近年來，抗生素大量使用造成了細(xì)菌耐藥的問題，噬菌體因為其特異性強(qiáng)，不會產(chǎn)生明顯的毒副作用，且不會破壞機(jī)體正常的菌群、引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒血癥等特點[45]，被認(rèn)為是一類重要的抗生素替代物，特別是針對耐藥菌株的抗生素替代物，得到了重新重視。

3.1 噬菌體的分類

自然界中噬菌體的種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的噬菌體超過5 100 種。按其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征分為有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體、立方體結(jié)構(gòu)的噬菌體、絲狀結(jié)構(gòu)的噬菌體、多形結(jié)構(gòu)的噬菌體，其中有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體最多，占96%。在有尾結(jié)構(gòu)的噬菌體中，長尾噬菌體又占61%[46]。按照噬菌體對宿主的作用方式的不同，可分為兩大類，即烈性噬菌體和溫和型噬菌體[47]。烈性噬菌體感染宿主菌后，會在宿主菌細(xì)胞內(nèi)迅速大量繁殖，進(jìn)而裂解宿主菌并釋放，進(jìn)一步侵染其他宿主菌。溫和型噬菌體在侵染宿主菌細(xì)胞后，噬菌體本身的遺傳物質(zhì)與宿主的核染色體會整合到一起，隨著宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制而復(fù)制，正常情況下噬菌體不會大量增殖，也不會裂解宿主菌[48]。

3.2 噬菌體對動物抗細(xì)菌感染的應(yīng)用研究

目前噬菌體對抗動物源細(xì)菌感染的研究主要包括致病性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等。Sheng 等[49]以小鼠為模型，飼喂噬菌體/細(xì)菌比率為2:102 的特異性噬菌體SHI 或SHI 與KH1 的混合物，結(jié)果表明噬菌體組小鼠在飼喂2～6 d后，糞便中無法檢出大腸桿菌O157:117，而對照組小鼠在10 d 后仍檢出大腸桿菌。隨后，把該噬菌體應(yīng)用于荷斯坦奶牛，實驗證明，噬菌體同樣可以減少奶牛腸道內(nèi)的大腸桿菌O157:117，但不能完全消除。孫宇杰等[50]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體SYJ4 對痢疾志賀菌（S.dysenteriae）CMCC(B)51105 引起的雞痢疾有一定的治療效果，在灌服噬菌體11 h 后，雞糞便中的志賀氏菌數(shù)就降到喂菌前103 CFU/g 水平，與鏈霉素的效果相當(dāng)，并在控制雞腸道志賀氏菌群數(shù)量上優(yōu)于鏈霉素。Atterbury 等[51]從2004-2005年分離到的232 株沙門氏菌噬菌體中挑選了3 株具有較寬噬菌譜的噬菌體進(jìn)行了抑制雞體內(nèi)的3 種血清型沙門氏菌（Salmonella enterica serotypesEnteritidis,Hadar,and Typhimurium）的試驗，結(jié)果顯示3 株噬菌體可有效地清除雞體內(nèi)的沙門氏菌（Salmonella enterica serotypesEnteritidis,Hadar,and Typhimurium），試驗同時提示選擇合適的噬菌體、優(yōu)化給藥時機(jī)和給藥方式是獲得抑菌效果的關(guān)鍵因素。李躍等[52]在患乳腺炎的奶牛中分離得到金黃色葡萄球菌4P-1，并利用4P-1 建立小鼠乳腺炎模型。通過灌乳的方式用噬菌體2Y-10 對該模型進(jìn)行了治療，結(jié)果表明噬菌體可以使乳腺組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著下降，緩解乳腺組織病變，有效地降低炎癥反應(yīng)。

3.3 噬菌體對耐藥菌株的抑菌作用研究

噬菌體對于耐藥菌株同樣擁有有效的殺菌作用。閆李俠等[53]以SPF 級昆明小鼠建立小鼠感染泛耐藥鮑氏不動桿菌的模型，分為試驗組和對照組，試驗組使用噬菌體AB46 治療，對照組給同等體積的肉湯治療。結(jié)果顯示：泛耐藥鮑氏不動桿菌1∶10稀釋試驗組與對照組，有統(tǒng)計學(xué)差異；1∶2、1∶5 稀釋組無統(tǒng)計學(xué)差異；1∶50 稀釋的試驗組與對照組均無小鼠死亡，脾菌數(shù)計數(shù)結(jié)果P=0.026，有統(tǒng)計學(xué)差異。證明，噬菌體可有效地治療泛耐藥鮑氏不動桿菌重癥感染的小鼠，明顯提高小鼠的生存率，在感染較輕的情況下則可以明顯降低小鼠的脾菌數(shù)。Biswas 等[54]利用噬菌體對耐萬古霉素腸球菌（ancomycin—resistant enterococci，VRE）進(jìn)行治療試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給試驗小鼠腹腔注射109CFU VRE 48 h后，小鼠全部死亡；但當(dāng)在感染后，僅給小鼠一次性注射3x108PFU 噬菌體即可100%存活；即使當(dāng)感染發(fā)生24 h 后，小鼠瀕臨死亡，噬菌體治療也可獲得50%的生存率。

3.4 噬菌體的制劑研究

目前研究噬菌體制劑的方向主要包括全菌噬菌體制劑、遺傳學(xué)改造的噬菌體制劑和噬菌體裂解酶制劑等。

全菌噬菌體制劑包括單一噬菌體制劑和雞尾酒制劑。由于噬菌體的高宿主特異性，單一的噬菌體制劑在臨床應(yīng)用上有很大的局限性，將具有不同噬菌譜的多種噬菌體制成混合制劑，稱為雞尾酒，且因其具有廣譜性、可降低耐受細(xì)菌出現(xiàn)的頻率，是全菌噬菌體制劑的主要研究方向[43]。2006年，美國FDA 批準(zhǔn)了首個噬菌體雞尾酒制劑ListexTMP100(Micreos 公司生產(chǎn))，用作食品添加劑[55]。

遺傳學(xué)改造的噬菌體制劑是旨在通過分子生物學(xué)的手段，對噬菌體的基因進(jìn)行編輯，以期能改變或擴(kuò)展噬菌體的宿主譜，延緩免疫系統(tǒng)對噬菌體的清除速度，減少內(nèi)毒素的釋放以及增強(qiáng)抗生素的療效，使其能更有效地應(yīng)用于臨床治療[56]。

噬菌體裂解酶制劑中的裂解酶是噬菌體編碼的產(chǎn)物，噬菌體通過裂解酶裂解宿主細(xì)胞完成殺菌作用。裂解酶主要作用于宿主的細(xì)胞壁，按作用于細(xì)胞壁肽聚糖共價鍵位點的不同，可將噬菌體裂解酶分為葡糖苷酶、酰胺酶、內(nèi)肽酶和轉(zhuǎn)糖基酶。裂解酶制劑具有特異性、高效性、較高的穩(wěn)定性、安全性以及潛在的廣譜殺菌性能，在特異性殺死宿主菌的同時，不易產(chǎn)生耐藥性[57]。

3.5 噬菌體替代抗生素存在的問題與展望

噬菌體在替代抗生素的應(yīng)用研究中存在的主要問題：噬菌體的安全性評價。噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，其病毒的本質(zhì)是其作為治療藥物的障礙，噬菌體是否能感染機(jī)體正常細(xì)胞，免疫系統(tǒng)對噬菌體的應(yīng)答反應(yīng)，噬菌體在裂解宿主菌時是否會釋放大量內(nèi)毒素和釋放的內(nèi)毒素對機(jī)體的影響，是否會導(dǎo)致內(nèi)毒血癥等疑慮一直存在，雖然目前已開始有大量安全性評價研究[45]，但其在制成制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)上的安全性仍需進(jìn)一步研究；噬菌體的選擇：噬菌體的高特異性是優(yōu)點也是缺點，作為替代抗生素的制劑，相對于抗生素的廣譜抗菌性，其噬菌譜較窄，單一噬菌體制劑難以起到很好的效果，噬菌體雞尾酒制劑雖然在一定程度上可以解決這個問題，但是雞尾酒制劑仍需及時更新和進(jìn)行不同的組合[43]，其離應(yīng)用于大規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的路還有很長距離；噬菌體制劑給藥劑量、給藥方式和給藥時間的把握是噬菌體治療效果的關(guān)鍵因素[49,51]，給養(yǎng)殖業(yè)具體操作者構(gòu)成了使用障礙；噬菌體的抗性問題：實驗發(fā)現(xiàn)單一培養(yǎng)的菌株可在數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)發(fā)展產(chǎn)生噬菌體抗性[58]。面對上述問題，未來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對噬菌體遺傳物質(zhì)的研究，如基因改造等以及噬菌體殺菌機(jī)制的研究等方面將是未來研究的重要方向[59]。

4 結(jié)語

隨著耐藥細(xì)菌的不斷發(fā)現(xiàn)，甚至是“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)，人類對于抗生素使用量的控制會越來越嚴(yán)格，落實到養(yǎng)殖業(yè)上，抗生素作為促生長劑和預(yù)防疾病用藥的時代必將過去。在此形勢下，涌現(xiàn)出了包括微生態(tài)制劑、中草藥制劑、噬菌體制劑等抗生素替代物，其各有優(yōu)點，但完全替代抗生素還存在很多問題，需要各國科學(xué)工作者進(jìn)一步研究。