斑馬魚模型在病毒研究中的應(yīng)用

談文盼，盧歡倩，王曉桐，趙文昌，宋麗軍

(廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523808)

病毒感染性疾病是嚴(yán)重危害我國(guó)乃至全世界人民健康的傳染病之一。目前，人們對(duì)病毒致病機(jī)制有一定程度的認(rèn)識(shí)，但對(duì)病毒與宿主間相互作用方式以及病毒調(diào)節(jié)基因表達(dá)仍然需要進(jìn)一步研究。采用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)和適宜的動(dòng)物感染模型是病毒學(xué)研究的經(jīng)典方法，但限于病毒的易感性及組織特異親和性等，目前尚無(wú)合適的細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物模型用于病毒研究。斑馬魚屬于輻鰭魚綱鯉形目鯉科短擔(dān)尼魚屬的硬骨魚，個(gè)體小、生長(zhǎng)周期短、易于繁殖且早期胚胎透明[1-2]。由于斑馬魚與人類基因組、遺傳、免疫高度相似，其被廣泛應(yīng)用于人類疾病(如腫瘤、阿爾茨海默病、心臟病以及細(xì)菌感染性疾病)的研究[3-5]。近年來(lái)，相繼報(bào)道了病毒感染性疾病在斑馬魚中的研究[6-9]。斑馬魚具有可以實(shí)時(shí)觀察示蹤、基因編輯、高通量和高內(nèi)涵的抗病毒藥物篩選等優(yōu)勢(shì)，因此成為較好的研究病毒侵染的模式動(dòng)物，為揭示宿主-病毒相互作用機(jī)制提供了較好的技術(shù)平臺(tái)[10-11]。現(xiàn)就斑馬魚模型在病毒感染研究中的應(yīng)用予以綜述，以期為病毒的感染途徑、機(jī)制、病毒與宿主的相互作用及抗病毒藥物篩選等的研究提供理論依據(jù)。

1 斑馬魚的抗病毒免疫炎癥機(jī)制

斑馬魚具有與哺乳動(dòng)物類似的免疫器官、細(xì)胞以及免疫相關(guān)細(xì)胞因子和調(diào)控通路，同時(shí)具備先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，在病毒感染后會(huì)產(chǎn)生一系列的抗病毒反應(yīng)[12-13]。炎癥反應(yīng)是維持細(xì)胞正常功能所必需的防御反應(yīng)，而促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-8和白細(xì)胞介素-6等對(duì)促進(jìn)炎癥以及巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向感染部位的趨化是必不可少的。例如，腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6在幼魚中被誘導(dǎo)而導(dǎo)致斑馬魚全身感染鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)[14]。但炎癥反應(yīng)也需要精密控制，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)宿主造成傷害。許多病毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，病毒可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡逃避宿主細(xì)胞的免疫過(guò)程。例如，SVCV感染斑馬魚以巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)，白細(xì)胞介素-1β釋放和細(xì)胞凋亡參與了病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡的全過(guò)程[15-17]。

除炎癥因子外，斑馬魚的免疫相關(guān)調(diào)控通路亦與人類相似，通過(guò)對(duì)魚類彈狀病毒感染斑馬魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染斑馬魚后，Toll樣受體、視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體等介導(dǎo)的干擾素反應(yīng)以及補(bǔ)體途徑等被激活，促分裂原活化的蛋白激酶、髓樣分化因子88/核因子κB炎癥信號(hào)通路等參與抗病毒應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程[18-19]，為人類病毒性疾病在斑馬魚身上的研究提供了可靠的免疫學(xué)基礎(chǔ)。

基因編輯技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了宿主抗病毒機(jī)制的研究。Liu等[9]通過(guò)基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)了叉頭框O3B基因(forkhead box O3B，F(xiàn)oxO3B)-/-突變型斑馬魚幼魚，并發(fā)現(xiàn)FoxO3B可以與干擾素調(diào)節(jié)因子3和干擾素調(diào)節(jié)因子7相互作用，抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3/7的轉(zhuǎn)錄活性，從而使干擾素激活受到抑制；FoxO3B-/-突變型斑馬魚幼魚感染SVCV后的抵抗力增強(qiáng)，并且病毒基因的表達(dá)水平低于野生型斑馬魚，表明FoxO3B基因參與了病毒感染的控制，并具有抑制病毒基因表達(dá)的功能。這些發(fā)現(xiàn)為揭示抗病毒免疫機(jī)制和病毒防治提供了研究基礎(chǔ)。

2 與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病毒相關(guān)的斑馬魚模型

在自然界中，目前尚無(wú)斑馬魚感染人類病毒，但魚類病毒能夠感染斑馬魚的幼魚和成魚，并導(dǎo)致疾病。SVCV、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和蛇頭魚彈狀病毒以及諾達(dá)病毒科病毒是引起魚類傳染病的重要病原[20]。由于這些魚類病毒的最佳復(fù)制溫度(通常低于24 ℃)較低，因此溫度可能對(duì)斑馬魚的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫反應(yīng)能力有一定的影響，但有研究顯示，即使在15 ℃時(shí)斑馬魚仍然能夠產(chǎn)生有效的抗病毒免疫反應(yīng)[21]。因此，低溫環(huán)境對(duì)病毒感染的斑馬魚免疫功能的影響還需要進(jìn)一步的研究。

2.1RNA病毒

2.1.1彈狀病毒科 彈狀病毒科病毒是危害全球野生型和養(yǎng)殖型魚類的主要病原之一。而SVCV是彈狀病毒科家族中一種具有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，感染后的魚類出現(xiàn)眼球突出、腹部腫脹、皮下出血以及內(nèi)臟淤血等[22-23]。SVCV可以感染斑馬魚成魚和幼魚，成魚通過(guò)浸泡或腹腔注射感染，而幼魚則常通過(guò)尾部血島、尾靜脈和卵黃等部位經(jīng)顯微注射或浸泡感染[24]。SVCV感染斑馬魚模型用于干擾素和炎癥反應(yīng)方面的研究取得了顯著進(jìn)展，被應(yīng)用于腫瘤壞死因子-α阻斷宿主的自噬反應(yīng)研究中，突出了斑馬魚在研究抗病毒新藥和宿主定向治療方面的潛力，證實(shí)了Ⅰ型干擾素在斑馬魚中的抗病毒活性[25]。

最早在斑馬魚上進(jìn)行研究的病毒——蛇頭魚彈狀病毒，最初被應(yīng)用于研究病毒Nonvirion基因的功能，成魚常以腹腔注射方式感染，而胚胎則多以浸泡方式感染。利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚，Gabor等[26]證明了黑色素瘤分化相關(guān)基因5依賴性途徑在抗病毒免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為蛇頭魚彈狀病毒感染機(jī)制的研究提供了新思路。另一個(gè)彈狀病毒屬成員——病毒性出血性敗血癥病毒，該病毒在春季或秋季流行，魚類感染后最早在嘴、鰓、鰭部和皮膚開始出血，病毒性出血性敗血癥病毒感染模型已被用于疫苗和佐劑效價(jià)的研究，如感染前給予單寧酸可以降低斑馬魚的病死率[27-28]。此外，斑馬魚對(duì)水皰性口炎病毒易感，其感染對(duì)象主要是動(dòng)物和昆蟲[29]。水皰性口炎病毒不能通過(guò)浸泡或口服方式感染斑馬魚胚胎，神經(jīng)毒性也嚴(yán)重阻礙著其作為臨床藥物的開發(fā)[30]。水皰性口炎病毒感染斑馬魚模型的建立，為未來(lái)水皰性口炎病毒的防治和抗病毒藥物篩選奠定了模型基礎(chǔ)。

2.1.2其他病毒科

2.1.2.1諾達(dá)病毒科神經(jīng)性壞死病毒(nervous necrosis virus，NNV) NNV屬于β諾達(dá)病毒屬，NNV分布廣、耐受力強(qiáng)、毒性大，感染后致死率非常高。NNV能夠感染斑馬魚幼魚和成魚，成魚常通過(guò)腹腔注射感染NNV，感染后的魚漂游于水面，并伴有游泳不協(xié)調(diào)等典型的NNV感染癥狀[31]；而幼魚的生存情況與感染方式有關(guān)，通過(guò)顯微注射方式感染的幼魚24 h后出現(xiàn)高死亡率，而浸泡方式感染幼魚的生存情況取決于魚的發(fā)育階段，魚齡偏大的幼魚表現(xiàn)出更高的存活率[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素反應(yīng)對(duì)生存率起著至關(guān)重要的作用，視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ的剔除可導(dǎo)致感染NNV后的細(xì)胞炎癥反應(yīng)下調(diào)[33]。此外，作為研究病毒發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)元變性的潛在動(dòng)物模型，已有研究利用NNV感染斑馬魚模型評(píng)估了結(jié)合病毒特異性納米抗體和抗病毒藥物的多壁碳納米管靶向治療病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性[34]。

2.1.2.2傳染性胰腺壞死病毒 傳染性胰腺壞死病毒屬于雙鏈RNA病毒科的水生雙鏈RNA病毒屬，是已知魚類病毒中最小韻RNA病毒[35]。傳染性胰腺壞死病毒具有高傳染性，感染后的死亡率高達(dá)90%，這種病毒給全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[36]。LaPatra等[37]揭示了使用傳染性胰腺壞死病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)感染斑馬魚造血細(xì)胞的潛力，這為造血細(xì)胞疾病模型提供了新的可能。雖然傳染性胰腺壞死病毒可以感染斑馬魚，但仍然缺乏進(jìn)一步的研究。目前尚無(wú)有效防治傳染性胰腺壞死病毒的藥物和疫苗，預(yù)防病毒暴發(fā)引起的死亡對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖至關(guān)重要，可以通過(guò)研究斑馬魚獲得的有效信息對(duì)疫苗進(jìn)行改進(jìn)。

2.2DNA病毒——虹彩病毒科 虹彩病毒科包括許多從昆蟲和其他一些動(dòng)物分離的胞質(zhì)型DNA病毒。來(lái)自虹彩病毒科的傳染性脾腎壞死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)和歐洲鯰魚病毒(European salmon virus，ESV)可在斑馬魚上成功復(fù)制。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ISKNV感染主要采用腹腔注射的方式，感染后皮膚出現(xiàn)瘀點(diǎn)，鱗屑突出；自然條件下，ISKNV也能感染斑馬魚，感染后的魚表現(xiàn)出嗜睡、食欲不振、游泳異常以及結(jié)腸腔擴(kuò)張等，嚴(yán)重情況下甚至出現(xiàn)呼吸窘迫、腮鰭蒼白和鰭底部出血等[6]。ISKNV可以刺激斑馬魚模型中干擾素調(diào)節(jié)因子7在斑馬魚脾臟中的表達(dá)增加，在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著類似轉(zhuǎn)錄激動(dòng)劑的作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，魚干擾素調(diào)節(jié)因子1對(duì)魚類DNA病毒具有抑制作用[38-39]。此外，Qi和Xiang[40]發(fā)現(xiàn)，Daxx蛋白在斑馬魚的細(xì)胞凋亡和先天免疫中發(fā)揮一定的作用。這些發(fā)現(xiàn)為揭示抗病毒免疫機(jī)制和病毒防治提供了研究基礎(chǔ)。ESV在斑馬魚上的應(yīng)用較少，截至目前僅通過(guò)重組ESV方法證明了ESV可以有效感染斑馬魚[41]。表明斑馬魚可作為研究虹彩病毒發(fā)病機(jī)制的模型，用于探索其他基因在病毒和宿主間的相互作用以及新型魚疫苗的研究。

3 人易感病毒的斑馬魚模型

近年來(lái)，學(xué)者探索了斑馬魚模型在人類病毒性疾病研究中的應(yīng)用。斑馬魚體溫和人類有一定差距，限制了該模型用于人類病毒性疾病的生物研究，但斑馬魚模型仍然成功用于許多人類病毒性疾病的研究[42]。目前，已經(jīng)有單純皰疹病毒1型、基孔肯雅病毒、辛德畢斯病毒、甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)5種人類病毒斑馬魚模型被成功建立。

3.1RNA病毒

3.1.1甲病毒科 甲病毒屬屬于披膜病毒科，感染后往往引起兒童出血熱綜合征、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱等癥狀，基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒是其中的兩種?；卓涎挪《景唏R魚模型多用于研究病原體-宿主的相互作用。Palha等[43]通過(guò)靜脈注射受精后3 d的幼魚，成功建立基孔肯雅病毒感染斑馬魚模型，揭示了中性粒細(xì)胞在基孔肯雅病毒遏制中起至關(guān)重要的作用，感染后的斑馬魚可以恢復(fù)健康狀態(tài)，且恢復(fù)程度依賴于宿主Ⅰ型干擾素的響應(yīng)情況。該研究首次完成了對(duì)整個(gè)脊椎動(dòng)物的體內(nèi)成像，并成功觀察到病毒感染的細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的情況。由于基孔肯雅病毒主要傳播途徑是蚊蟲叮咬，所以感染方式一般選擇顯微注射感染，這一發(fā)現(xiàn)為研究登革病毒或寨卡病毒等其他病原體提供了可能。辛德畢斯病毒是研究病毒性腦炎的公認(rèn)模型，該感染方式同樣模仿蚊蟲叮咬的自然感染，且基孔肯雅病毒和辛德畢斯病毒感染斑馬魚所出現(xiàn)的癥狀相似，說(shuō)明甲病毒科病毒感染疾病的發(fā)病機(jī)制是保守的?；卓涎挪《竞托恋庐吽共《揪灰蕾嚲奘杉?xì)胞介導(dǎo)的運(yùn)輸進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，不同點(diǎn)在于基孔肯雅病毒總是先感染腦血管的內(nèi)皮細(xì)胞，相比之下辛德畢斯病毒的軸突運(yùn)輸效率比基孔肯雅病毒高[44]。在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，斑馬魚作為模型可為研究腦病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防方法提供強(qiáng)大的可視化成像系統(tǒng)。

3.1.2其他病毒科

3.1.2.1正黏病毒科 正黏病毒科是指對(duì)人或某些動(dòng)物紅細(xì)胞表面的黏蛋白有親和性的病毒，但實(shí)際上只有流行性感冒病毒一個(gè)種屬，又稱流感病毒群，人類IAV是其中的一種。IVA可以造成斑馬魚胚胎的全身性感染，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)，通過(guò)熒光標(biāo)記IAV，可實(shí)現(xiàn)病毒感染宿主整個(gè)過(guò)程的可視化。例如，將熒光標(biāo)記的IAV顯微注射到受精后2 d的斑馬魚胚胎中，觀察到病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程[45]。此外，由于斑馬魚感染IVA后引發(fā)的水腫、組織破壞等癥狀與人類臨床病理癥狀相似，可利用該模型篩選抗病毒藥物的有效性。研究發(fā)現(xiàn)，與正常個(gè)體相比，患有杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的個(gè)體對(duì)IAV更易感[46]，說(shuō)明在患有遺傳性肌肉疾病的人群中預(yù)防IAV感染的重要性。

3.1.2.2HCV HCV屬于黃病毒科，是一種具有脂質(zhì)外殼的單股正鏈RNA病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有1.85億人感染HCV，感染率約為3%，每年新發(fā)HCV感染病例有300萬(wàn)～400萬(wàn)，嚴(yán)重危害人類的生命和健康[47]。HCV可以在斑馬魚上復(fù)制，且斑馬魚中HCV相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化與感染人肝細(xì)胞后的變化一致[48]。另外，通過(guò)HCV感染斑馬魚模型還發(fā)現(xiàn)，人類自噬相關(guān)蛋白10的兩種同工型對(duì)HCV亞基因組復(fù)制子具有相反的作用[49]。HCV感染斑馬魚模型除了可以作為藥物篩選和評(píng)估模型外，更多的應(yīng)用還需要進(jìn)一步探索。

3.2DNA病毒——皰疹病毒科 皰疹病毒是雙鏈DNA病毒，感染的宿主范圍廣泛，可感染人類和其他脊椎動(dòng)物。單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科α病毒亞科。目前單純皰疹病毒主要分為1型和2型，1型主要由口唇病灶獲得。通過(guò)單純皰疹病毒1型感染斑馬魚模型，證明單純皰疹病毒1型可以與宿主細(xì)胞的病毒表面糖蛋白D受體結(jié)合形成脂質(zhì)體-病毒混合物，經(jīng)過(guò)非受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞[50]。表明脂質(zhì)體介導(dǎo)病毒感染可在斑馬魚模型中實(shí)現(xiàn)以及病毒表面糖蛋白D受體可能增強(qiáng)基因治療病毒載體的遞送。除了可以作為脂質(zhì)體介導(dǎo)的病毒感染模型外，單純皰疹病毒1型斑馬魚感染模型還可作為研究胞質(zhì)DNA感應(yīng)機(jī)制的可行模型[51]。由于該病毒模型的文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此其后續(xù)應(yīng)用和開發(fā)尚需進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

斑馬魚與人類的基因組具有高度相似性，其心血管、神經(jīng)以及代謝系統(tǒng)的解剖生理學(xué)和分子生理學(xué)與哺乳動(dòng)物非常相似，是一種理想的動(dòng)物模型。隨著轉(zhuǎn)基因和基因剔除魚研究的不斷增多，利用斑馬魚構(gòu)建病毒感染模型可深刻揭示病毒的侵染轉(zhuǎn)化途徑、宿主的病理變化以及與病毒相關(guān)的特定基因蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)新的病理機(jī)制和新的靶點(diǎn)。在未來(lái)研究中，可以利用斑馬魚模型研究埃博拉病毒、諾如病毒、柯薩奇病毒等，特別是與遺傳學(xué)發(fā)育生物學(xué)相關(guān)的病毒性疾病(如輪狀病毒)等。同時(shí)，應(yīng)盡快構(gòu)建斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的體內(nèi)、體表微生物以及病原體和組學(xué)研究，分析斑馬魚微生物組的組成等，確立不同潔凈級(jí)別的斑馬魚，為病毒學(xué)的研究提供新的模式生物，為抗病毒藥物的研究提供高效的技術(shù)平臺(tái)。