液態(tài)奶中乳果糖檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

延新宇 鄭百芹 周 鑫

1.河北省唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北唐山063000

乳果糖是新鮮的液態(tài)奶經(jīng)過(guò)巴氏殺菌或超高溫瞬時(shí)（ultra-high-temperature,UHT）滅菌后，乳糖被異構(gòu)化，分子中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖而形成的一種雙糖。在液態(tài)奶加熱過(guò)程中，乳果糖的含量有明顯增加，因此乳果糖是衡量新鮮液態(tài)奶熱處理工藝評(píng)定的重要指標(biāo)之一[1]。

1 乳果糖的概念

20 世紀(jì)50 年代，Adachi 發(fā)現(xiàn)在牛奶加熱過(guò)程中，出現(xiàn)了一種合成雙糖，這種雙糖被稱為乳果糖。隨著乳果糖的發(fā)現(xiàn)，20 世紀(jì)60 年代，Richards 等[2]就在脫脂乳粉中檢測(cè)到了乳果糖。隨后，Andrews[3]發(fā)現(xiàn)了LA 運(yùn)轉(zhuǎn)和Amadori 重排反應(yīng)是形成乳果糖的主要條件。

乳果糖，又名乳酮糖、半乳糖苷果糖和1-4-β-半乳糖苷果糖，是在堿性條件下，乳糖發(fā)生異構(gòu)化產(chǎn)生的一種雙糖[3]。乳果糖含有一半分子的半乳糖和一半分子的果糖，是乳糖的同分異構(gòu)體。

乳果糖是一種低熱值、高安全性的還原性二糖，其具有特殊保健功能。乳果糖在消化過(guò)程中不能被小腸吸收，進(jìn)入大腸中被大腸中的雙歧桿菌利用，調(diào)整腸道菌的平衡，對(duì)雙歧桿菌起到平衡作用[4]；乳果糖可以降低腸道的pH 值，從而抑制有害菌的繁殖，使體內(nèi)毒素明顯減低；乳果糖被證明具有促進(jìn)乙肝后肝硬化患者的肝功能恢復(fù)和保護(hù)腸道黏膜屏障的功能[5]；除此之外，乳果糖還可以用來(lái)預(yù)防便秘，具有增強(qiáng)身體的免疫力、促進(jìn)人體對(duì)鈣、鎂的吸收等作用。

2 液態(tài)奶中乳果糖的檢測(cè)方法

由于乳果糖的特殊性，可以將其作為衡量液態(tài)奶所經(jīng)受熱負(fù)荷的關(guān)鍵指標(biāo)之一。國(guó)內(nèi)外對(duì)乳果糖的檢測(cè)有著較高的關(guān)注。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，乳果糖的檢測(cè)方法越來(lái)越簡(jiǎn)單、快速和精準(zhǔn)。目前乳果糖檢測(cè)存在的最主要問(wèn)題：液態(tài)奶中的乳果糖含量較低，在測(cè)定時(shí)，高含量的乳糖會(huì)對(duì)其處理過(guò)程和最終檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此不同的檢測(cè)方法也都提出了各自的解決方法。目前，乳果糖的測(cè)量方法較多[6-10]，主要有離子色譜法、MTT 顯色法、微分pH 計(jì)法[11]、生物傳感器法、氣相色譜法、安培電流計(jì)法、離子交換色譜法、酶解法、高效液相色譜法和傅立葉變換紅外光譜法等。我國(guó)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中乳果糖的測(cè)定方法是酶解法（標(biāo)準(zhǔn)NY/T939-2016）[12]，同時(shí)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織規(guī)定測(cè)定乳果糖的方法是ISO 酶法。

2.1 酶 法

酶法是目前應(yīng)用比較廣泛的一種方法。酶法根據(jù)酶的添加量和培養(yǎng)溫度可分為ISO 酶法和快速酶法。主要原理是利用β- 半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶將乳糖、乳果糖和葡萄糖水解，可以對(duì)測(cè)定結(jié)果減少干擾。然后再利用相關(guān)酶將之前產(chǎn)生的果糖一步步水解成NADPH，再測(cè)定NADPH 的吸光值就可以得到乳果糖的含量?？焖倜阜ㄊ屈S萌萌等[13]將ISO 酶法中水解乳果糖的培養(yǎng)溫度從40 ℃提高到50 ℃，從而達(dá)到快速測(cè)定牛乳中乳果糖含量的目的，最終命名為快速酶法。巴氏殺菌乳和新鮮牛乳都可以用快速酶法來(lái)檢測(cè)乳果糖含量。

利用酶法來(lái)檢測(cè)液態(tài)奶中的乳果糖，其方法檢出限為1 mg/L，可以很準(zhǔn)確地進(jìn)行測(cè)量，具有一定的穩(wěn)定性和可靠性。但是也存在一些缺點(diǎn)，不僅成本高、檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)，而且在操作中還容易受到微生物的污染，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

2.2 色譜法

1）高效液相色譜法。高效液相色譜法（HPLC）主要是利用沉淀劑將液態(tài)奶中的蛋白質(zhì)和脂肪沉淀，然后再通過(guò)高效液相色譜測(cè)定乳果糖的含量，應(yīng)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[14]、示差檢測(cè)器[15-16]、脈沖安培檢測(cè)器等檢測(cè)乳果糖的濃度，其中脈沖安培檢測(cè)器的靈敏度較高，可以對(duì)微量乳果糖進(jìn)行檢測(cè)。劉麗君等[17]利用氨基色譜柱分離、示差檢測(cè)器檢測(cè)，由于示差檢測(cè)器穩(wěn)定性和靈敏度較低的緣故，無(wú)法準(zhǔn)確地對(duì)乳果糖含量較低的滅菌乳進(jìn)行測(cè)量。液相色譜法一般使用反向柱對(duì)乳果糖進(jìn)行分離測(cè)定。由于乳果糖和乳糖是同分異構(gòu)體，二者保留時(shí)間相近，很難加以分離，因此選擇合適的色譜柱、合適的流動(dòng)相，對(duì)液相色譜法檢測(cè)乳果糖十分重要。

利用高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)乳果糖，若配置脈沖安培檢測(cè)器來(lái)測(cè)量，其檢測(cè)限為0.4 mg/L。高效液相色譜法還可以檢測(cè)其他糖類的濃度，在測(cè)量乳果糖時(shí)也可以很好地避免其他糖類的干擾，得到準(zhǔn)確值[18-19]。但是在測(cè)量乳果糖過(guò)程中，其前處理中蛋白質(zhì)和脂肪的去除比較繁瑣。

2）氣相色譜法。氣相色譜法主要是將液態(tài)奶中的蛋白質(zhì)和脂肪沉淀，之后進(jìn)行過(guò)濾，使用0.01%苯基-β-D- 葡萄糖溶液作為內(nèi)標(biāo)對(duì)乳果糖的含量進(jìn)行測(cè)定。氣相色譜法是一種靈敏度高、準(zhǔn)確性高且可重復(fù)地檢測(cè)乳果糖含量的檢測(cè)方法，并且也可以對(duì)其他糖類進(jìn)行測(cè)量。在檢測(cè)碳水化合物時(shí)，要先將多糖分解成為單糖，之后將單糖合理衍生，得到易于氣化的物質(zhì)，再利用氣相色譜儀分析。其靈敏度要比高相液相色譜法高。當(dāng)用利用氣相色譜檢測(cè)乳果糖和分離其他糖類時(shí)，一般采用毛細(xì)管柱。Montilla 等[20]利用甲烷硅基化糖類的氣體毛細(xì)管色譜法對(duì)乳果糖進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果的精密度較高。之后又利用此方法對(duì)多種牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定。其結(jié)果表示，此方法具有較高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，并且可以很好地分離乳糖和乳果糖。

利用氣相色譜法來(lái)檢測(cè)乳果糖，其定量限為50～100 mg/L。但是有報(bào)道稱利用毛細(xì)管柱，采用特定的溫度梯度，對(duì)乳果糖進(jìn)行測(cè)量，其檢測(cè)限低至0.50 mg/L。氣相色譜法具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)定周期短的優(yōu)點(diǎn)，但是液態(tài)乳中其他糖類需要合理地進(jìn)行衍生，從而更好地提高檢測(cè)的靈敏度。

3）離子色譜法。離子交換色譜法也是常見(jiàn)的乳果糖檢測(cè)方法之一。Tommaso 等[21]采用氫氧化鈉溶液和乙酸鋇作為淋洗液，用陰離子交換分離和脈沖安培檢測(cè)方法檢測(cè)。該方法存在缺點(diǎn)，易生成碳酸鋇沉淀，柱子的使用壽命和淋洗液的穩(wěn)定性都受到了影響。2008 年曾文芳等[22]采用了氫氧化鈉和乙酸鈉作為淋洗液，陰陽(yáng)離子交換分離，該方法可以使淋洗液預(yù)處理簡(jiǎn)單化，從而得到無(wú)毒、價(jià)廉的淋洗液。

4）薄層色譜法。薄層色譜法是以薄層吸附劑為固定相，溶劑為流動(dòng)相，能夠快速分離和定性分析少量物料。朱桂蘭等[23]在2004 年通過(guò)薄層色譜儀檢測(cè)低聚糖乳果糖，建立了低聚乳果糖的薄層色譜分析法。薄層色譜法具有微量、快速、分離效率高和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但該方法只能作為定性不能作為定量分析。

2.3 其他方法

微分pH 計(jì)法也可以對(duì)乳果糖的含量進(jìn)行測(cè)定。其主要原理是由于分解葡萄糖和果糖時(shí)產(chǎn)生H+，從而利用微分pH 計(jì)來(lái)測(cè)定pH 值，根據(jù)pH 值變化來(lái)分析出被分解的乳果糖的含量。在實(shí)際樣品中，最低pH 值變化可以縮小到0.01 mpH。此外MTT 顯色法也是通過(guò)相應(yīng)的酶水解乳果糖，溶液最后產(chǎn)生帶有顏色的MTT，再利用分光光度計(jì)來(lái)定量檢測(cè)。這些方法雖然測(cè)定周期短且靈敏度高，但是由于操作比較繁瑣且處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，所以并沒(méi)有得到廣泛的推廣。

3 結(jié)語(yǔ)

ISO 酶法是目前比較成熟的一種檢測(cè)方法，其應(yīng)用的儀器相對(duì)操作簡(jiǎn)單，能夠很準(zhǔn)確地對(duì)乳果糖進(jìn)行測(cè)定；色譜法具有很高的分辨率和準(zhǔn)確性，其中高效液相色譜法和氣相色譜法都是發(fā)展很高的技術(shù)，并且有大量的研究正在對(duì)乳果糖進(jìn)行檢測(cè)。其中氣相色譜法的不足之處為需要將乳果糖合理衍生。而相對(duì)應(yīng)用較少的MTT 顯色法和微分pH 計(jì)法等方法，這些方法雖然測(cè)定周期短且靈敏度高，但是由于操作比較繁瑣，目前還沒(méi)有很好地進(jìn)行普及。就酶法和色譜法而言，酶法比大多數(shù)色譜法定量限低且操作簡(jiǎn)便，但是其中高效液相色譜法具有很高的分辨率且能準(zhǔn)確分離乳果糖和其他糖類。

隨著乳果糖近年來(lái)逐漸被重視，對(duì)其檢測(cè)技術(shù)也在不斷探索。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)液態(tài)奶中乳果糖的檢測(cè)技術(shù)研究十分關(guān)注。雖然針對(duì)液態(tài)奶中乳果糖含量的檢測(cè)方法已有大量研究，但是還沒(méi)有一種高效、低成本、操作簡(jiǎn)便且抗干擾強(qiáng)的技術(shù)出現(xiàn)。因此，建立一種高效、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。