卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)對(duì)子代表觀遺傳學(xué)的影響

王楠，倪俊學(xué)，轉(zhuǎn)黎

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650051；2.云南省第一人民醫(yī)院 a.兒科，b.生殖醫(yī)學(xué)科，昆明 650032)

近年來，男性不育患者的數(shù)量逐年上升，大多數(shù)表現(xiàn)為少精子癥、弱精子癥、畸形精子癥、死精子癥及無精子癥等，若治療不當(dāng)可造成終生不育，影響家庭和睦，不利于提升我國生育質(zhì)量。隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)水平的提升，很多不孕不育的家庭選擇ART完成生育。其中卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)具有不受精子數(shù)量和形態(tài)影響、受精率高等優(yōu)點(diǎn)，成為臨床上治療男性不育癥的重要方法之一，也是目前治療男性不育最有效的技術(shù)[1]。雖然臨床上ICSI的應(yīng)用比較成功，但I(xiàn)CSI出生子代的安全性問題引起人們的關(guān)注，成為全球醫(yī)源性健康問題之一。為了研究ICSI對(duì)ICSI子代表觀遺傳學(xué)的影響及其是否增加ICSI子代出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步深入調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，部分運(yùn)用ART出生的子代患有印跡基因錯(cuò)誤、先天畸形、出生低體重等表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象異常，其中也包括表觀遺傳缺陷所導(dǎo)致的一些遺傳疾病[2-3]。有研究表明，臨床上運(yùn)用ART的新鮮或冷凍胚胎的子代出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)較高，但仍需更多研究來闡明運(yùn)用體外受精技術(shù)(in vitro fertilization，IVF)和ICSI后新鮮或冷凍胚胎周期對(duì)子代出生缺陷的影響[4]。另有研究表明，ART中ICSI子代出生缺陷率與常規(guī)IVF子代出生缺陷率相似，但均高于自然妊娠子代出生缺陷率[5-6]。其中，ICSI是否引起子代出生缺陷已成為臨床研究的主要問題。雖然已有研究表明，如果胚胎植入前不進(jìn)行遺傳學(xué)篩選，采用ICSI的精子在運(yùn)行過程中一旦發(fā)生不完全表觀遺傳修飾，就會(huì)使出生子代的遺傳表型發(fā)生異常[7]。但是，關(guān)于人類表觀遺傳變化導(dǎo)致的胚胎發(fā)育不良、胎盤功能障礙和出生缺陷到底是由ICSI引起的還是父母中已存在的醫(yī)學(xué)或遺傳條件的后果，仍存在爭論。探究ICSI對(duì)子代出生缺陷的影響以及對(duì)出生子代表觀遺傳學(xué)具體存在哪些方面影響的意義有助于探討ICSI出生子代相關(guān)基因、微RNA表達(dá)水平與出生缺陷之間的相關(guān)性，更有助于為ICSI子代出生缺陷機(jī)制與子代表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象探索尋找證據(jù)?，F(xiàn)對(duì)ICSI對(duì)其子代表觀遺傳學(xué)的影響進(jìn)行綜述。

1 ICSI概述

ICSI主要針對(duì)嚴(yán)重少精、弱精、無精、畸形精子癥男性患者，由于精子數(shù)量過少或精子形態(tài)功能缺陷而不能正常穿透卵母細(xì)胞透明帶，無法完成受精過程或受精率下降。其中，對(duì)于無精子癥的患者，通過手術(shù)從附睪或睪丸中獲取精子進(jìn)行ICSI可能是唯一的治療方法[8]。ICSI不僅包括配子與胚胎體外培養(yǎng)過程，還需借助顯微注射儀操作系統(tǒng)將篩選出的優(yōu)質(zhì)單一精子注射入單一卵細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)受精，雖然對(duì)卵子的傷害最低，但卻干擾了配子發(fā)生、胚胎發(fā)育甚至整個(gè)妊娠過程的大環(huán)境，在卵子MⅡ期干擾了正常的受精過程和植入前胚胎的發(fā)育過程，并且ICSI在顯微操作過程中將外源性物質(zhì)注入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，破壞了卵子和紡錘體等結(jié)構(gòu)，這些操作均可能對(duì)配子的受精和后續(xù)胚胎的分化及發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。

一項(xiàng)動(dòng)物研究表明，在卵母細(xì)胞中，表觀遺傳印跡是在原始卵泡向腔內(nèi)卵泡轉(zhuǎn)化過程中建立的，直到排卵前印跡模式才能完全確定某些基因，因此體外環(huán)境的改變可能導(dǎo)致子代表觀遺傳修飾異常[10]。ICSI可能誘發(fā)胚胎表觀遺傳畸變、影響ICSI受孕兒童的發(fā)育，為未來更好地改進(jìn)和完善ICSI提供了方向。

2 子代表觀遺傳學(xué)概述

表觀遺傳學(xué)是指在不涉及基因的核苷酸序列改變的情況下，基因表達(dá)水平和功能發(fā)生改變，最終使子代表型發(fā)生變化，表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象的性狀和特征可以直接觀察到，由環(huán)境與基因型共同決定[11]。表觀遺傳修飾異?？赡茉谛纬膳渥?、受精和早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)生，因此在不改變DNA序列的情況下生物學(xué)和環(huán)境因素可以影響后代的表觀遺傳重新編程[12]。表觀遺傳編碼程序分為三個(gè)階段，第一階段發(fā)生于原始生殖細(xì)胞中，涉及全基因組去甲基化；第二階段建立新的甲基化模式；最后一個(gè)階段在胚胎發(fā)生早期，通過某些基因的主動(dòng)去甲基化和被動(dòng)去甲基化來實(shí)現(xiàn)。表觀遺傳重新編程涉及多個(gè)相互依賴的調(diào)節(jié)機(jī)制，如共價(jià)組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、DNA甲基化和非編碼RNA等，因此，配子和胚胎在體外暴露于人工條件和非生理介質(zhì)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致表觀遺傳突變[13]。有證據(jù)表明，甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化是組蛋白對(duì)基因調(diào)控的主要方式[14]。印跡是表觀遺傳學(xué)基因調(diào)控的一種形式，當(dāng)有不同的等位基因表達(dá)時(shí)，這種基因的表達(dá)取決于親本的性別，而不改變其潛在的DNA序列在配子發(fā)生和植入前發(fā)育過程中，印跡調(diào)節(jié)的改變會(huì)破壞正常的生長發(fā)育，導(dǎo)致印跡紊亂。研究發(fā)現(xiàn)有100多個(gè)已知的印跡基因，并且不適當(dāng)?shù)谋碛^遺傳調(diào)控可能導(dǎo)致基因表達(dá)異?；虮硇透淖?，但醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中僅描述了9種經(jīng)典印跡障礙，而表觀遺傳學(xué)的分子機(jī)制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后，主要與DNA、RNA和組蛋白相關(guān)[10]。ICSI是治療男性不育的有效方法之一，但是在克服精子數(shù)量、活力、形態(tài)異常引起的受精障礙的同時(shí)也跨越了機(jī)體的自然選擇機(jī)制，使存在表觀遺傳學(xué)異常的精子與卵子受精結(jié)合，導(dǎo)致出生子代攜有同樣表觀遺傳學(xué)異常的風(fēng)險(xiǎn)升高。因此，可通過研究ICSI對(duì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制的影響，從而確定ICSI具體對(duì)子代表觀遺傳學(xué)有哪些方面影響，為ICSI出生子代生殖遺傳安全性的評(píng)估提供科學(xué)、有效的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

3 ICSI對(duì)子代表觀遺傳學(xué)的影響

3.1印跡基因位點(diǎn)甲基化異常 目前，ART相關(guān)表觀遺傳學(xué)研究主要集中于基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控，包括DNA甲基化和組蛋白修飾等，以印跡位點(diǎn)甲基化異常的研究最豐富。人類妊娠后10～11周，原始生殖細(xì)胞甲基化水平降到最低，而后進(jìn)入甲基化重編程[15]。印跡基因位點(diǎn)甲基化一般發(fā)生于配子形成期，印跡基因的缺失會(huì)導(dǎo)致其雄配子基因組不能在成熟卵母細(xì)胞中獲得相應(yīng)的印跡基因，兩次DNA甲基化重編程過程中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可使胚胎發(fā)育異常，導(dǎo)致遺傳疾病的發(fā)生，使子代缺陷的患病率升高[11]。如鉀離子通道蛋白家族印跡調(diào)控區(qū)和小核核糖核蛋白多肽N基因印跡調(diào)控區(qū)的異常低甲基化分別導(dǎo)致了貝-威綜合征和天使綜合征[16]。不育癥男性患者的某些精子含有錯(cuò)誤的印跡基因，選中此類精子會(huì)增加子代遺傳的風(fēng)險(xiǎn)[17]。在小胎齡嬰兒中印跡丟失和表觀遺傳標(biāo)記改變，與自然妊娠子代相比，IVF與ICSI子代胎盤的DNA甲基化模式和基因表達(dá)譜發(fā)生了改變[18]。在97例不育男性檢查中發(fā)現(xiàn)印跡基因GTL 2(gene trap locus 2)和h19發(fā)生紊亂，表明男性不育與精子中印跡位點(diǎn)甲基化異常相關(guān)[19-20]。無生育能力患者的印跡基因胰島素樣生長因子Ⅱ/H19印跡控制區(qū)1(imprinting control region 1，ICR 1)低甲基化，發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量低與印跡基因胰島素樣生長因子Ⅱ、H19 ICR 1低甲基化有關(guān)[21]。若ICSI注入的精子呈圓形或長形時(shí)可能為印跡不完全的配子，這也會(huì)增加子代發(fā)生印跡基因缺陷的風(fēng)險(xiǎn)，一些少精子癥患者精子中存在的印跡位點(diǎn)甲基化異常現(xiàn)象也可遺傳給子代[22]。研究顯示精子質(zhì)量越差，印跡位點(diǎn)的甲基化改變?cè)矫黠@[23-24]。約40%子代DNA甲基化異常與其父本精子的異常相同[25-26]。因此，印跡基因位點(diǎn)甲基化異常親本進(jìn)行ICSI可使子代攜帶同樣缺陷的概率升高。ICSI還可增加印跡疾病的發(fā)生率，并可通過未成熟的精子建立適當(dāng)?shù)挠≯E或甲基化異常而對(duì)胚胎的發(fā)育產(chǎn)生不利影響，因此篩選印跡基因位點(diǎn)甲基化精子可作為精子質(zhì)量評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志之一[27]，也是選擇表觀遺傳合格的精子運(yùn)行ART降低世代之間遺傳風(fēng)險(xiǎn)的有效方法。因此，臨床上運(yùn)用ART時(shí)應(yīng)先進(jìn)行遺傳診斷篩選，避免攜帶有印跡基因位點(diǎn)甲基化異常的精子與卵子受精結(jié)合，降低出生子代發(fā)生印跡基因缺陷或印跡疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2子代先天畸形 陸續(xù)有大規(guī)模的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ICSI出生子代存在出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)高于正常妊娠子代，且ICSI在胚胎體外培養(yǎng)過程中由于環(huán)境改變使父系DNA損傷導(dǎo)致精子永久遺傳或表觀遺傳改變，這種改變可以傳給子代，造成子代先天畸形[28]。臨床上，ART子代出現(xiàn)先天畸形的案例也有很多。有研究發(fā)現(xiàn)，ICSI多胎妊娠嬰兒的先天性畸形風(fēng)險(xiǎn)顯著高于自然妊娠嬰兒，如唇裂或腭裂、眼睛、耳朵、面部和頸部、呼吸、肌肉骨骼、神經(jīng)和消化系統(tǒng)畸形[29-30]。采用ART出生子代的視覺功能和眼部形態(tài)由于水平和質(zhì)量低，尚無定論。對(duì)采用不同ART的648例新生兒進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，10例患有疾病，ICSI組中性逆轉(zhuǎn)1例、唇腭裂2例；IVF組先天性心臟病、血管瘤、腎積水和睪丸鞘膜積液各1例；供精人工授精組先天性心臟病3例[31]。IVF和ICSI還可增加出生子代多指的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與手多指有關(guān)[32]。近年來較多臨床研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ICSI子代發(fā)生先天畸形的概率不斷增加，因此除了在運(yùn)行ICSI之前需進(jìn)行遺傳診斷篩選外，更要在進(jìn)行ICSI體外培養(yǎng)時(shí)保護(hù)好環(huán)境，降低ICSI子代先天畸形的發(fā)生率。同時(shí)仍需更多高質(zhì)量研究對(duì)ICSI治療及出生子代先天畸形的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行評(píng)估。

3.3對(duì)子代體重的影響 出生子代體重異常也是反映ICSI對(duì)子代表觀遺傳學(xué)影響的重要指標(biāo)之一，自然妊娠子代與ICSI子代的體重可能存在差異。在ICSI周期中，由于配子和胚胎接受人工培養(yǎng)基改變了激素和化學(xué)環(huán)境，從而造成DNA甲基化、表觀遺傳修飾等后果，并且培養(yǎng)基不同也可導(dǎo)致ICSI子代出生時(shí)的平均出生體重顯著變化[33]。在運(yùn)用ICSI 體外胚胎培養(yǎng)時(shí)對(duì)培養(yǎng)基的選擇也需要進(jìn)一步研究和認(rèn)證。有研究發(fā)現(xiàn)，接受ART后的單胎妊娠增加了早產(chǎn)、高血壓、產(chǎn)前產(chǎn)后出血、胎盤紊亂和出生低體重的風(fēng)險(xiǎn)，ICSI中單胎女嬰的出生體重低于自然妊娠中的單胎女嬰[34]。另外，ICSI子代患有代謝紊亂、心血管疾病和惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)略有增加，且存在多胎妊娠、早產(chǎn)和低出生體重等風(fēng)險(xiǎn)[35]。一些國家和國際出生登記的研究數(shù)據(jù)表明，IVF和ICSI孕育的單胎嬰兒出現(xiàn)不良圍生結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)增加[36]。因此，ICSI出生子代體重的改變和單胎嬰兒不良圍生結(jié)局的出現(xiàn)可能與父系、母系所攜帶的遺傳基因無關(guān)，而與ICSI本身的操作與環(huán)境等相關(guān)。與自然妊娠的嬰兒相比，ART子代更容易出現(xiàn)宮內(nèi)生長受限、出生體重低、早產(chǎn)和圍生期死亡[36]。雖然，已有一些研究證明了ICSI對(duì)子代體重的影響，但是具體的影響機(jī)制有待于研究與拓展。

4 展 望

采用ART出生的子代大部分均表現(xiàn)出與自發(fā)受孕兒童相同的健康水平，其中ICSI已經(jīng)成為臨床上治療男性不育的首選方法，但大多數(shù)男性不育的病因尚不清楚，異常的表觀遺傳標(biāo)記可使精子改變，甚至造成男性不育。ICSI可直接處理和選擇形態(tài)合格的精子用于治療男性不育，但也可帶來較大風(fēng)險(xiǎn)，很多表觀遺傳現(xiàn)象或者疾病可通過ISCI遺傳給子代使子代出現(xiàn)某些缺陷，因此ICSI對(duì)子代表觀遺傳學(xué)的影響值得被重視。在應(yīng)用ICSI治療男性不育癥前進(jìn)行大量臨床研究與評(píng)估，按照不同年齡階段對(duì)ICSI出生子代進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)分析ICSI對(duì)子代表觀遺傳學(xué)影響的程度；可以運(yùn)用高通量測(cè)序?qū)Τ錾哟獦舆M(jìn)行基因檢測(cè)，分析ICSI是否對(duì)子代表觀遺傳學(xué)存在影響及其相關(guān)的影響機(jī)制。

如何提高ICSI精準(zhǔn)化治療和降低ICSI對(duì)子代表觀遺傳學(xué)的影響甚至消除，從而獲得健康ICSI子代值得更深入的研究。也為ICSI出生子代缺陷發(fā)生機(jī)制探索尋找證據(jù)，為將來的子代印跡綜合征、代謝綜合征、癌癥等治療提供臨床依據(jù)。相信隨著ICSI 的不斷完善與發(fā)展，可以在今后的科學(xué)研究以及臨床實(shí)踐等諸多領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。