垂體泌乳素腺瘤的動物模型和發(fā)病機制研究進展

王雄，馬莉，吳金虎

(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院 武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060)

垂體瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的15%，泌乳素腺瘤是最易發(fā)生的垂體瘤，在各種類型的垂體腫瘤中，泌乳素腺瘤的所占比例高達67%[1]。泌乳素腺瘤是發(fā)生于垂體前葉的泌乳素上皮細胞腫瘤，是由泌乳素細胞瘤分泌過量泌乳素而導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)疾病。根據(jù)腫瘤的大小，可分為微腺瘤(直徑<1 cm)、大腺瘤(直徑為1～3 cm)和巨大腺瘤(直徑>3 cm)；按其侵襲性，有侵襲性腺瘤和非侵襲性腺瘤之分。泌乳素腺瘤典型的臨床表現(xiàn)為：女性閉經(jīng)、溢乳、高泌乳素血癥、不育等；男性乳房發(fā)育、性功能減退、陽痿等；另外，侵襲性的腫瘤還會侵犯周圍神經(jīng)結(jié)構(gòu)和組織而引起其他的癥狀和病變。目前，國內(nèi)治療藥物僅有溴隱亭一種，溴隱亭治療效果顯著，但價格昂貴，且存在一定的不良反應(yīng)(如胃腸道反應(yīng))，劑量較大時可有眩暈、直立性低血壓、頭痛、瞌睡及便秘等；20%的泌乳素腺瘤患者經(jīng)溴隱亭治療后出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，對溴隱亭耐藥或?qū)ζ洳涣挤磻?yīng)不耐受的患者，尚無替代治療藥物[2-3]。近年來，垂體泌乳素腺瘤的研究取得了一定進展，但其發(fā)病機制目前尚不完全清楚，同時臨床治療藥物也有限。現(xiàn)就垂體泌乳素腺瘤動物模型和發(fā)病機制的研究進展予以綜述。

1 垂體泌乳素腺瘤的動物模型

1.1雌激素誘發(fā)垂體瘤模型 雌激素誘發(fā)垂體瘤是目前最常用的垂體泌乳素腺瘤造模方法，造模時間較短，費用較低，模型穩(wěn)定可靠。切除雌性大鼠卵巢后，通過攝入外源性雌激素使垂體泌乳素腺瘤生長，此模型與人類泌乳素腺瘤高度相似，便于探索疾病的發(fā)病機制。雌激素誘發(fā)垂體瘤模型使用的大鼠品系主要有F344(fischer 344)[3]大鼠和Wister(wistar-furth)[4]大鼠，BN(brown norway)大鼠和Holtzman大鼠難以通過此方法成功造模[5]，主要原因可能是不同品系大鼠對雌激素敏感性存在一定的差異。其中，給予雌激素誘導(dǎo)幾周后，F(xiàn)344大鼠腺體異常增長，血清泌乳素水平也顯著增高[3]。F344品系大鼠對雌激素敏感，造模周期較短，模型較穩(wěn)定，一般情況下選擇此品系大鼠進行造模。

1.2轉(zhuǎn)基因動物垂體瘤模型 近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，對泌乳素腺瘤的分子生物學(xué)研究也逐漸深入。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌類腫瘤形成的根本原因可能是基因突變的結(jié)果[6]，垂體泌乳素腺瘤的形成與許多基因的調(diào)控相關(guān)[7]。目前開發(fā)的轉(zhuǎn)基因模型制備方法是利用CRISPR/Cas系統(tǒng)將小鼠的某個基因敲除或?qū)⒛硞€基因敲入特定的DNA區(qū)域，然后通過直接顯微注射獲得目標(biāo)模型動物[8-9]。這是目前基因工程應(yīng)用中的一種最簡便、可靠、高效的造模方法，在特定基因?qū)δ[瘤影響的研究中十分有效。Seruggia和Montoliu[10]研究證實，多巴胺D2基因敲除小鼠可用于制備穩(wěn)定可靠的泌乳素腺瘤模型。Recouvreux等[11]通過用胚胎干細胞中D2基因靶向誘導(dǎo)雌性Drd2-/-小鼠，然后與野生型的雄性小鼠交配來進行擴繁，通過對小鼠的基因組DNA進行聚合酶鏈反應(yīng)來鑒定 Drd2+/+、雜合子和Drd2-/-的小鼠，這種模型通常在動物在8月齡時使用，此時Drd2-/-雌性小鼠垂體增生，腺瘤形成。

1.3可移植性垂體瘤模型 近年來，可移植性腫瘤模型的發(fā)展越來越成熟。目前，可移植垂體瘤模型按移植部位主要分為皮下移植、腎囊內(nèi)移植和顱內(nèi)移植3類[2]。主要是將供體腫瘤組織或經(jīng)原代培養(yǎng)的腫瘤細胞移植到受體體內(nèi)，并保證腫瘤正常生長。可移植性腫瘤模型受體無需雌激素誘導(dǎo)，腫瘤可在受體內(nèi)生長迅速，便于實驗觀察分析。Missale等[12-13]成功將人類泌乳素腺瘤細胞移植到裸鼠皮下，但未進行后續(xù)穩(wěn)定性研究。可移植性腫瘤模型與人類泌乳素腺瘤有一定的差別，且并非所有雌激素誘發(fā)的垂體瘤都有可移植性[13]，故仍需探索更加優(yōu)良的可移植瘤模型。

1.4自發(fā)性垂體瘤模型 動物自發(fā)性垂體瘤與人類泌乳素腺瘤較相似，但發(fā)生率較低，造模周期較長。研究發(fā)現(xiàn)，一些小鼠(C3H)和大鼠(SD)可產(chǎn)生自發(fā)性垂體瘤，Wistar大鼠也可產(chǎn)生自發(fā)性垂體瘤，但存在性別和年齡差異，雌性較雄性大鼠腫瘤發(fā)生率高，年齡越大腫瘤的發(fā)生率越高，但總體發(fā)生率較低，50周齡以下Wistar大鼠幾乎不發(fā)病[14]。其他品系大鼠自發(fā)垂體瘤的發(fā)生率很低，F(xiàn)344大鼠自發(fā)性垂體瘤發(fā)生率為20.5%，CD-1大鼠的發(fā)生率為1.1%[15-16]。故自發(fā)性垂體腫瘤模型雖具有一定優(yōu)勢，但構(gòu)建周期較長，垂體瘤發(fā)生率較低，且不便觀察，目前較少應(yīng)用。

2 垂體泌乳素腺瘤的發(fā)病機制

泌乳素腺瘤發(fā)生于垂體前葉，垂體前葉整合了控制甲狀腺、腎上腺等生殖和生長功能的激素信號通路。垂體通過促進激素分泌調(diào)控內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，但所獲得的垂體信號也會引起塑形的垂體生長反應(yīng)，包括功能性垂體細胞發(fā)育不良、過度增生和腺瘤形成等[17]。目前泌乳素腺瘤的發(fā)病機制尚不完全清楚，主要有幾種理論假設(shè)，包括雌激素/受體機制、基因的異常表達以及細胞因子、受體和信號通路的異常調(diào)節(jié)、微RNA(microRNA，miRNA)的調(diào)控等。

2.1雌激素/受體機制 雌激素可直接穿越細胞核膜，與相應(yīng)的核受體結(jié)合，形成二聚體作用于靶基因，啟動或修飾基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)相關(guān)基因表達。GH3/B6/F10 細胞膜雌激素受體(estrogen receptor，ER)豐富，給予10 nmol/L雌激素則細胞內(nèi)鈣離子水平增加；1 pmol/L和1 nmol/L雌激素即可引發(fā)細胞中泌乳素的釋放，且雌二醇和己烯雌酚尚能夠激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及與ERKs激活相關(guān)的通路[ER、表皮生長因子受體、膜組織化、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、Src激酶][18]。

2.2基因的異常表達 環(huán)境因素和遺傳因素共同導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其中基因的異常表達與人類腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。在細胞的生長增殖中，原癌基因和抑癌基因的調(diào)控非常重要。

2.2.1與泌乳素腺瘤相關(guān)的原癌基因 癌基因活化使細胞發(fā)生數(shù)量或結(jié)構(gòu)上的變化，導(dǎo)致細胞癌變，主要活化途徑有獲得啟動子與增強子、染色體異位、基因擴增和點突變。實驗證明，垂體瘤轉(zhuǎn)化基因 (pituitary tumor-transforming gene，PTTG)在大鼠正常垂體組織中不表達，但在雌激素成功誘導(dǎo)大鼠泌乳素腺瘤中高表達，并在體外培養(yǎng)的泌乳素腺瘤細胞中高表達，表明異常表達PTTG基因與泌乳素腺瘤的產(chǎn)生有較大的相關(guān)性[3]。并且，功能性人類泌乳素腺瘤也表達PTTG[19]，意味著人類泌乳素腺瘤中也存在特異性表達的原癌基因。

目前與PTTG基因相關(guān)的泌乳素腺瘤發(fā)生機制有以下推測：①PTTG與myc家族的c-myc癌基因啟動子結(jié)合后激活，從而使細胞無限增殖導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[18]；②PTTG基因可誘導(dǎo)成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)的分泌，F(xiàn)GF可促進腫瘤血管的形成，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20-21]；③PTTG基因調(diào)控區(qū)發(fā)生點突變使其表達水平異常，從而導(dǎo)致細胞增殖等一系列變化[22-23]。

2.2.2與泌乳素腺瘤相關(guān)的抑癌基因 抑癌基因也稱為腫瘤抑制基因，這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Zhou等[24]研究表明，與垂體腫瘤有關(guān)的多種腫瘤抑制基因可基于它們與腫瘤抑制基因Rb或p53的相互作用而被分成p53組和Rb組；p53蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，由p53基因編碼形成，控制細胞周期的啟動，若其失活或突變，將引起細胞的不斷增殖而形成腫瘤，而p53組與泌乳素腺瘤相關(guān)的抑癌基因包括MEG3(maternally expressed 3)、6-氧-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、多型性腺瘤基因樣蛋白1、Ras相關(guān)區(qū)域家族1基因、Ras相關(guān)區(qū)域家族3基因和細胞因子信號抑制分子1。Rb是視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白，由Rb基因編碼形成，Rb基因是人類克隆成功的第一個抗癌基因；Rb組與泌乳素腺瘤相關(guān)的抑癌基因包括細胞周期依賴性激酶抑制基因2A、細胞周期依賴性激酶抑制基因2B、細胞周期依賴性激酶抑制基因2C、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、鈣黏蛋白1、鈣黏蛋白13、生長停滯和DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白β、生長停滯和DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白45g、芳烴受體相互作用蛋白和多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子1(multiple endocrine neoplasia 1，MEN1)等[23]。其中p53組腫瘤抑制基因MEG3在垂體中發(fā)揮著重要的作用，Chunharojrith等[25]研究發(fā)現(xiàn)，p53的滅活完全消除了MEG3的腫瘤抑制，表明MEG3腫瘤抑制由p53介導(dǎo)。Rb組的MEN1基因也是一種與泌乳素腺瘤相關(guān)的腫瘤抑制基因，該基因編碼蛋白質(zhì)menin，Walls等[26]研究表明，MEN1基因過表達在體外抑制了細胞增殖。

2.2.3垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1(pituitary specific transcription factor，Pit-1) Pit-1是垂體中轉(zhuǎn)錄因子 POU homeodomain家族成員，是3種垂體前葉細胞(即親軀體細胞、泌乳素細胞以及甲狀腺激素釋放激素細胞)正常生長所必需的，對生長激素(growth hormone，GH)、泌乳素、甲狀腺刺激素亞基的表達以及甲狀腺激素受體、GH釋放激素受體和 Pit-1自身表達均十分必要；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)顯示，人泌乳素腺瘤中 Pit-1的表達增高[27]。大鼠Pit-1蛋白由273個氨基酸組成，包含N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和POU區(qū)，N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)負責(zé)Pit-1蛋白對于靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，POU區(qū)由POU特異區(qū)和POU源區(qū)組成，負責(zé)與靶基因的特異性結(jié)合；雌激素通過上調(diào)其受體和刺激Pit-1基因表達來增強泌乳素基因表達，誘發(fā)促性腺激素細胞轉(zhuǎn)化為泌乳素細胞，致大鼠泌乳素細胞中泌乳素表達增高以及高泌乳素血癥[28]。

在體內(nèi)條件下，存在依賴雌激素的ER與Pit-1蛋白的物理結(jié)合，且這種相互作用在調(diào)控泌乳素基因表達中發(fā)揮著重要作用。在泌乳素垂體瘤細胞中，蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮可阻斷復(fù)合物合成，減少雌激素激活的泌乳素基因表達，表明輔助蛋白因子參與了ER-Pit-1復(fù)合物形成及隨后的促泌乳素基因激活[29]。

2.3細胞因子調(diào)節(jié) 細胞因子被分為生長因子、炎癥因子、腫瘤壞死因子等。體內(nèi)的這些細胞因子通過各種自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用，對人體生理功能產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，與泌乳素腺瘤相關(guān)的生長因子有很多，F(xiàn)GF與血管生成相關(guān)，其中FGF-2及FGF-4均在泌乳素陽性垂體腺瘤中被發(fā)現(xiàn)；血管內(nèi)皮生長因子在侵襲性泌乳素腺瘤中高水平表達，可能與腫瘤新生血管有關(guān)[19]。PTTG可以促進FGF和血管內(nèi)皮生長因子的表達而誘導(dǎo)腫瘤血管的形成[20]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4是轉(zhuǎn)化生長因子-β家族成員之一。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4在雌激素誘發(fā)大鼠垂體泌乳素腺瘤及人類垂體泌乳素腺瘤中均過度表達，并可通過與ER的相互作用促進泌乳素分泌及泌乳素細胞增殖[30]。

2.4受體調(diào)控機制 多巴胺D2受體敲除的小鼠可形成泌乳素腺瘤，但具體的發(fā)病機制尚不明確[10]。多巴胺受體是含7個跨膜區(qū)域的G蛋白偶聯(lián)受體家族，可將胞外刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)。G蛋白的調(diào)節(jié)亞基Gαi可抑制腺苷酸環(huán)化酶，使環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)產(chǎn)生減少，進而使蛋白激酶A減少，蛋白激酶A可催化cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)絲氨酸殘基磷酸化，從而激活Pit-1[31]。而Pit-1是GH和泌乳素表達所必需的轉(zhuǎn)錄因子，Pit-1的啟動子包括1個Pit-1結(jié)合位點和2個CREB結(jié)合位點[32-34]。因此，CREB磷酸化水平的改變可使GH和泌乳素基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，進而導(dǎo)致泌乳素生成增加。

2.5細胞信號通路調(diào)控機制 目前與泌乳素腺瘤發(fā)生相關(guān)的信號通路包括：PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路或Ras/ERK信號通路的持續(xù)激活，能使敏感的細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞。有研究通過泌乳素腺瘤與正常垂體組織比較發(fā)現(xiàn)，垂體泌乳素腺瘤細胞中PI3K/Akt信號通路在最初的級聯(lián)反應(yīng)中被上調(diào)，PI3K/Akt和Ras/ERK信號通路通過酪氨酸激酶受體被激活，導(dǎo)致細胞周期抑制蛋白失活，從而導(dǎo)致細胞過度增殖，而信號通路的異常和通路之間的相互作用可能在垂體泌乳素腺瘤發(fā)生的初始階段發(fā)揮重要作用[35]；Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路，氟維司群是一種ER拮抗劑，可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制垂體瘤MMQ細胞的增殖和泌乳素的分泌[36]。

2.6miRNA的調(diào)控機制 miRNA是一類非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)大量基因的表達，在許多細胞過程中起著重要的作用。目前，在腫瘤的研究中對腫瘤所涉及的miRNA的研究十分重視，也取得了很多重大的進展。對垂體泌乳素腺瘤相關(guān)的miRNA的探索也取得了一定成就，它將作為一種新型的生物標(biāo)志物用于疾病的檢測和治療。Bottoni等[37]發(fā)現(xiàn)，在泌乳素腺瘤中miR-15a和miR-16-1的表達顯著下調(diào)。之后，對于miRNA的研究逐漸深入，研究證實，垂體腺瘤中表達上調(diào)的miRNA有miR-23a、miR-107、miR-150、miR-152、miR-191、miR-192和miR-212[38]以及 miR-26a和miR-26b[39]；表達下調(diào)的主要有miR-23b、miR-130b、miR-34b、miR-570、miR-603、miR-128a、miR-132、miR-24、miR-98、miR-143、miR-145和let-7[34]。miRNA通過其特定的靶基因來調(diào)控機體的反應(yīng)。目前對于miRNA具體調(diào)控哪些靶基因的表達雖有一定的基礎(chǔ)研究，但具體機制尚不明確，需繼續(xù)深入探索。

3 小 結(jié)

垂體泌乳素腺瘤對人類生殖健康產(chǎn)生了極大的危害，經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者多年的探索，垂體泌乳素腺瘤的研究取得了很多進展。目前垂體泌乳素腺瘤的動物模型制作方法均不夠完善。泌乳素腺瘤發(fā)病機制的研究已發(fā)展到細胞和分子水平，存在多種理論假說，但仍需進一步的研究來闡明其確切的發(fā)病機制。因此，急需研發(fā)出更精準的泌乳素腺瘤動物模型，深入開展泌乳素腺瘤發(fā)病機制的研究，為后期垂體泌乳素腺瘤的治療和臨床藥物研發(fā)提供依據(jù)。