細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5的生物學(xué)功能與相關(guān)疾病治療

馬寧，邢怡橋

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心，武漢 430060)

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是一組結(jié)構(gòu)相似且分子量為34 000～40 000的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它們在生物進(jìn)化中高度保守，存在于所有真核細(xì)胞生物中，并在各種細(xì)胞內(nèi)普遍表達(dá)。每個(gè)CDK蛋白均有一個(gè)蛋白激酶結(jié)合口袋組成的催化中心、一個(gè)PSTAIRE-樣與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)序列以及一個(gè)與CDK活化激酶結(jié)合的激活區(qū)域[1]。大多數(shù)CDK在細(xì)胞中通過與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，形成活性激酶復(fù)合物，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄、信使RNA加工以及神經(jīng)細(xì)胞的分化[2]。在CDK家族中，CDK5非常特殊，其激活物并不是細(xì)胞周期蛋白，主要生理作用也不是調(diào)控細(xì)胞周期，CDK5在增殖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞均有激活。在早期研究中，僅在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)CDK5被p35(CDK5活化劑1)激活，故認(rèn)為CDK5與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)[3]。近年來，隨著對CDK5的深入研究發(fā)現(xiàn)，CDK5不僅在多種實(shí)體和血液惡性腫瘤中上調(diào)并激活，也在血管形成以及胰島素調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，并逐漸成為抗癌藥物有希望的靶標(biāo)之一?，F(xiàn)就CDK5生物學(xué)功能以及相關(guān)疾病治療的研究進(jìn)展予以綜述。

1 CDK5的特性和功能

1.1特征與結(jié)構(gòu) CDK5的蛋白質(zhì)編碼基因位于染色體7q36上，包括12個(gè)外顯子。CDK5結(jié)構(gòu)與CDK家族其他成員相似，具有PSTAIRE-樣結(jié)構(gòu)序列[4]，但也有許多方面與其他CDK不同。通常CDK需要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合后發(fā)揮生物活性，但與CDK5結(jié)合的為p35和p39(CDK5活化劑2)，p35、p39為同源蛋白質(zhì)，翻譯表達(dá)后位于細(xì)胞膜上，兩者雖然可以直接與CDK5結(jié)合，但復(fù)合體不能釋放入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生理功能，必須轉(zhuǎn)化為p25和p29形式，與CDK5相結(jié)合形成CDK5/p25、CDK5/p29后釋放入細(xì)胞質(zhì)[5]。與其他CDK相同，CDK5與p25、p29的結(jié)合位點(diǎn)也位于PSTAIRE-樣結(jié)構(gòu)，但p25和p29在非神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)甚少，缺少兩者并不影響細(xì)胞正常分裂增殖；另外，細(xì)胞周期蛋白與CDK結(jié)合后可以直接引發(fā)CDK的磷酸化，但CDK5/p25、CDK5/p29復(fù)合體還需經(jīng)過多種酪氨酸激酶作用才能成功使CDK5磷酸化，從而產(chǎn)生活性[6]。

1.2生物學(xué)功能 CDK5對不同組織產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CDK5參與神經(jīng)生長錐的形成，支持突觸發(fā)生、神經(jīng)突向外生長；正常情況下，哺乳動(dòng)物中的CDK5在神經(jīng)組織水平較高，其次為睪丸組織，在其他組織中均為低水平表達(dá)，且在神經(jīng)組織中p35表達(dá)明顯，CDK5激活活性高于其他組織[7]。在CDK5顯性失活突變體中，可觀察到中樞神經(jīng)突觸生長減慢、神經(jīng)皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)倒錯(cuò)以及皮質(zhì)層上層中間神經(jīng)元堆積，說明CDK5與中樞神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)元遷移密切相關(guān)[8]。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Drebrin)是一種在肌動(dòng)蛋白絲側(cè)面結(jié)合的捆綁蛋白，可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚集以及神經(jīng)元生長錐形成。研究發(fā)現(xiàn)，CDK5通過將Drebrin轉(zhuǎn)化為開放構(gòu)象，暴露其末端與結(jié)合蛋白微管關(guān)聯(lián)蛋白RP/EB家族成員3(EB3)的結(jié)合位點(diǎn)，而Drebrin/EB3/CDK5在絲狀偽足中將肌動(dòng)蛋白與微管進(jìn)行偶聯(lián)，促進(jìn)生長錐形成，是神經(jīng)元樹突棘形成的基礎(chǔ)[9]。

同時(shí)，CDK5能影響血管、淋巴管的形成。Liebl等[10]通過抑制CDK5減少了體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的偽足形成以及小鼠角膜血管環(huán)形成。之后，Bosutti等[8]進(jìn)一步證實(shí)，CDK5在腦微血管細(xì)胞中與p25結(jié)合促進(jìn)血管生成。抑制CDK5后，非小細(xì)胞肺癌[11]、肝細(xì)胞癌[12]、骨肉瘤[13]體外以及體內(nèi)的血管密度均有下降，腫瘤生長減緩。此外，CDK5對淋巴管的形成產(chǎn)生影響。Liebl等[14]在內(nèi)皮組織特異性敲除CDK5小鼠中發(fā)現(xiàn)，全身淋巴管密度減小、管腔與瓣膜形態(tài)異常，而CDK5缺失對淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的大小、增殖和細(xì)胞周期幾乎沒有影響，似乎CDK5僅影響內(nèi)皮細(xì)胞“成管”功能。進(jìn)一步免疫印跡發(fā)現(xiàn)，CDK5影響叉頭框蛋白C2磷酸化水平，而缺乏叉頭框蛋白C2可導(dǎo)致淋巴管形成失敗和淋巴重構(gòu)[15]。

CDK5在中性粒細(xì)胞中激活，參與了炎癥反應(yīng)過程。在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性全身炎癥反應(yīng)模型中，小鼠海馬中的CDK5水平顯著增高，而在藥物抑制CDK5后，模型中的白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等水平顯著降低[16]。Lee等[17]使用鳥苷三磷酸刺激中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)波形蛋白磷酸化增強(qiáng)，波形蛋白與CDK5共定位，兩者可以免疫共沉淀，而在抑制CDK5后，波形蛋白磷酸化水平降低，并降低了炎癥反應(yīng)中中性粒細(xì)胞的分泌功能和遷移能力。

2 CDK5在相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用

2.1抗腫瘤治療 腫瘤細(xì)胞具有生長失控、可以持續(xù)分裂增殖的特點(diǎn)，細(xì)胞周期相較正常細(xì)胞明顯縮短，CDK是癌癥研究的熱點(diǎn)之一。其被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種癌癥細(xì)胞中異常表達(dá)，可促進(jìn)實(shí)體腫瘤的血管、瘤體生長以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]。在非小細(xì)胞肺癌患者中，CDK5表達(dá)增加的患者往往預(yù)后更差，癌癥轉(zhuǎn)移提前[18]。在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，抑制CDK5的表達(dá)或激活可以減少癌細(xì)胞的生長、降低遷移能力，使用CDK5抑制劑Roscovitine，可以降低非小細(xì)胞肺癌[11]、肝細(xì)胞癌[12]、骨肉瘤[13]動(dòng)物模型的新生血管密度，抑制瘤體生長。而抑制或敲低CDK5，可減少人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中CDK5/p25的異常激活，降低細(xì)胞的遷移能力，且使培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞極性喪失[19]。在胃癌和肺癌的疾病模型中，抑制CDK5也能顯著減少移植于小鼠癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[20-21]。

同時(shí)，CDK5還參與了線粒體凋亡途徑，抑制CDK5可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗癌作用。NavaneethaKrishnan等[22]發(fā)現(xiàn)，敲除CDK5的乳腺癌細(xì)胞中活性氧類和鈣離子水平顯著高于正常細(xì)胞，線粒體出現(xiàn)去極化、碎片化，細(xì)胞凋亡顯著增多；在使用環(huán)孢菌素A或薩菲菌素A關(guān)閉線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔后，敲除CDK5的細(xì)胞內(nèi)活性氧類水平降低，線粒體去極化、細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象減少，說明CDK5與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的功能有關(guān)，敲除CDK5可以導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。在非實(shí)體瘤中，CDK5抑制劑Dinaciclib對急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞也產(chǎn)生顯著的促凋亡作用，并延長了移植人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞小鼠的生存期，提高了存活率[23]。另外，CDK5還參與了癌癥的發(fā)生。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，其過度激活是癌變的原因，抑制STAT3可抑制腫瘤細(xì)胞的生長[24]?，F(xiàn)已證實(shí)，在前列腺癌細(xì)胞、甲狀腺髓樣癌細(xì)胞中磷酸化的STAT3水平升高，抑制CDK5后STAT3的磷酸化水平下降，且減慢了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外的生長[25-26]。同時(shí)，Courapied等[27]在HT29結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CDK5與STAT3免疫共沉淀，可直接引發(fā)STAT3的磷酸化，并確定CDK5/STAT3途徑通過下調(diào)DNA損傷修復(fù)基因Eme1的表達(dá)影響DNA修復(fù)，表明CDK5/STAT3通路參與了正常細(xì)胞到癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程。此外，CDK5的活性抑制劑Roscovitine以及Dinaciclib在癌癥治療方面已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[28]，CDK5作為癌癥治療的新靶點(diǎn)值得期待。

2.2中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療 中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是一組由慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)組織退行性變性而產(chǎn)生的疾病的總稱，是以大腦和脊髓神經(jīng)系統(tǒng)中特定的神經(jīng)元損傷、丟失為主要病理特征的疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等。雖然病因及病變的部位各不相同，發(fā)病機(jī)制也尚不明確，但神經(jīng)組織發(fā)生退行性病理學(xué)改變是其共同的特征。CDK5對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的必要性，使其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究開展廣泛。

帕金森病是一種主要表現(xiàn)為進(jìn)行性錐體外系功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Binukumar 等[29]在小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)變性導(dǎo)致的帕金森病模型中，檢測到CDK5/p25的過度激活；而使用來源于p25的TFP5短肽抑制CDK5/p25激活，可改善動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能，減少體外培養(yǎng)細(xì)胞炎癥與凋亡情況。為明確CDK5與帕金森病的聯(lián)系，有學(xué)者對帕金森病患者的腦脊液和血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帕金森病激活炎癥小體，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥因子增加；而在魚藤酮誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型中對CDK5進(jìn)行條件性敲除，發(fā)現(xiàn)敲除CDK5可以使白細(xì)胞介素-1β等炎癥因子下調(diào)，抑制炎癥小體產(chǎn)生[16]。這進(jìn)一步明確了CDK5與帕金森病的聯(lián)系，即CDK5在帕金森病中激活并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。另外，他莫昔芬作為成熟的乳腺癌、卵巢癌藥物，人們試圖了解其對CDK5是否產(chǎn)生影響，結(jié)果證明，他莫昔芬也可與p25相互作用以降低體內(nèi)CDK5/p25的活性[30]。臨床中他莫昔芬因?yàn)檗卓勾萍に貙ι窠?jīng)元的保護(hù)作用，故在使用其治療乳腺癌等疾病時(shí)，被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致帕金森病患病風(fēng)險(xiǎn)增加[31]；而在左旋多巴誘發(fā)雄性大鼠帕金森病的實(shí)驗(yàn)中，他莫昔芬被證實(shí)有治療效果[32]，但目前尚不清楚CDK5是否作用其中。

阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，學(xué)術(shù)界比較認(rèn)可的主要有Tau蛋白過度磷酸化和氧化應(yīng)激學(xué)說、膽堿能學(xué)說、β-淀粉樣蛋白毒性學(xué)說等。在阿爾茨海默病相關(guān)研究中，Watamura等[33]發(fā)現(xiàn)，正常情況下CDK5刺激威奧綜合征蛋白家族富含脯氨酸同源蛋白1、腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2及Tau蛋白磷酸化，從而刺激軸突生長，但在病理情況下上述蛋白過度磷酸化激活，產(chǎn)生神經(jīng)原纖維纏結(jié)，而神經(jīng)原纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病的主要病理變化。此外，在其他神經(jīng)退行性病變，如hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模擬的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥模型中，也有CDK5和Tau蛋白的上調(diào)[34]。Tau蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微管的形成和穩(wěn)定，一般認(rèn)為Tau蛋白的過度表達(dá)和激活會(huì)使細(xì)胞中Tau蛋白聚集、微管結(jié)構(gòu)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、淀粉樣蛋白產(chǎn)生，引起神經(jīng)炎癥，與帕金森病以及阿爾茨海默病的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)[35]。CDK5作為一種新發(fā)現(xiàn)的Tau蛋白激活蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)病變中意義重大。已有研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的神經(jīng)元遷移和癌細(xì)胞遷移可能由非常相似的細(xì)胞和分子機(jī)制介導(dǎo)[36]，CDK5、Tau蛋白的異常激活引起神經(jīng)原纖維纏結(jié)，而在癌癥組織中CDK5、Tau蛋白也常異常表達(dá)[37]，但CDK5在兩類疾病中的作用是否有相同之處或經(jīng)由相同分子通路還需深入研究。

2.3抗青光眼治療 青光眼作為致盲性眼病，以病理性眼壓升高、視神經(jīng)損害和視野缺損為特征，其中病理性眼壓升高為主要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅著人類的視覺健康。CDK5與視神經(jīng)的損害存在關(guān)聯(lián)，抑制CDK5活性可以改善青光眼中視神經(jīng)的損害。Chen等[38]通過燒灼鞏膜外靜脈誘發(fā)小鼠形成慢性青光眼發(fā)現(xiàn)，慢性青光眼小鼠視網(wǎng)膜中的CDK5、p25表達(dá)增加，對小鼠腹腔注射CDK5抑制劑Roscovitine后雖然不能降低眼壓，但減少了視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。另外，在體外培養(yǎng)的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中構(gòu)建糖氧剝奪模型，或添加衣霉素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡發(fā)現(xiàn)，抑制CDK5均能降低細(xì)胞死亡率，保護(hù)細(xì)胞功能[39]。青光眼中視神經(jīng)的損害與慢性神經(jīng)退行性疾病有不少相似之處，但抑制CDK5在青光眼中的作用與CDK5在帕金森病等其他疾病中的作用機(jī)制是否相同，還需要進(jìn)一步研究。

病理性高眼壓是青光眼的重要危險(xiǎn)因素，眼壓升高是引起視神經(jīng)、視野損害的重要因素。眼壓越高，高眼壓持續(xù)時(shí)間越長，導(dǎo)致視神經(jīng)損害的危險(xiǎn)性越大。有學(xué)者通過觀察體外培養(yǎng)的豬眼小梁網(wǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，加入CDK5抑制劑Roscovitine可以誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生明顯收縮；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對兔使用Roscovitine滴眼可以降低眼壓[40]。對CDK5的抑制可能通過促進(jìn)小梁網(wǎng)組織收縮，使小梁網(wǎng)海綿樣結(jié)構(gòu)中的“孔洞”變大，房水更容易通過小梁網(wǎng)進(jìn)入鞏膜靜脈竇，從而降低眼壓。而在燒灼鞏膜外靜脈誘發(fā)的慢性青光眼模型中，Roscovitine并未降低眼壓[38]，其原因可能為靜脈回流已經(jīng)被阻斷，房水排出受到阻礙，故促進(jìn)小梁網(wǎng)組織收縮并不能降低眼壓。

青光眼中高眼壓的機(jī)械壓迫及其導(dǎo)致的低血流灌注，使視神經(jīng)細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，纖維軸漿運(yùn)輸中斷、神經(jīng)營養(yǎng)因子供給缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致缺血再灌注損傷、細(xì)胞凋亡等一系列級聯(lián)反應(yīng)。Klinman和Holzbaur[41]在小鼠分離出的背根節(jié)神經(jīng)元中觀察軸漿運(yùn)輸，發(fā)現(xiàn)Roscovitine降低CDK5活性對軸漿運(yùn)輸幾乎沒有影響，但添加外援性p25增加CDK5活性顯著減慢了軸漿運(yùn)輸?shù)乃俣取？梢?，CDK5在青光眼模型中的異常激活可能是青光眼軸漿運(yùn)輸中斷的原因之一。以上研究表明，CDK5與青光眼疾病發(fā)生、發(fā)展的各階段均有密切聯(lián)系。

2.4糖尿病治療 胰島素抵抗與胰島素分泌減少是糖尿病發(fā)病的兩個(gè)主要環(huán)節(jié)，對CDK5的干預(yù)可能同時(shí)促進(jìn)胰島素分泌增加、保護(hù)胰島β細(xì)胞以及改善外周組織胰島素敏感性。Zheng等[42]發(fā)現(xiàn)，在高濃度葡萄糖環(huán)境下(25 nmol/L)培養(yǎng)的Min6胰島β細(xì)胞，較低葡萄糖環(huán)境下(3 nmol/L)細(xì)胞中CDK5/p25的活性升高；使用腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)p25，Min6胰島β細(xì)胞內(nèi)CDK5/p25活性顯著升高，受葡萄糖刺激后，胰島素分泌顯著少于正常細(xì)胞，也更容易發(fā)生凋亡；而進(jìn)一步使用p35來源的CDK5活性抑制肽抑制CDK5/p25活性，成功逆轉(zhuǎn)p25過表達(dá)細(xì)胞在高糖下的凋亡與低胰島素釋放。因此，抑制CDK5/p25活性可以保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，促進(jìn)胰島素釋放。

L型電壓依賴型鈣離子通道是影響胰島β細(xì)胞的重要離子通道之一。正常情況下，葡萄糖升高使胞質(zhì)中的ATP增加，導(dǎo)致ATP敏感性鉀通道關(guān)閉，細(xì)胞膜去極化，引起L型電壓依賴型鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流并刺激胰島素釋放[43]。Wei等[44]在高糖環(huán)境下培養(yǎng)小鼠胰島β細(xì)胞，并使用膜片鉗觀察細(xì)胞電位變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對CDK5的敲低或活性抑制導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，胰島素釋放增加，在添加ATP敏感性鉀通道開放劑二氮嗪后，抑制CDK5活性則不會(huì)引起胰島素釋放。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是已知的調(diào)節(jié)外周組織胰島素敏感性因子，在肥胖癥小鼠脂肪組織中CDK5和PPARγ同時(shí)被激活；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CDK5可以引起PPARγ第273位絲氨酸磷酸化，而羅格列酮等治療糖尿病的藥物可以抑制這種磷酸化發(fā)生，使用羅格列酮或Roscovitine治療小鼠，均能降低小鼠脂肪組織中的PPARγ磷酸化水平，改善組織胰島素敏感性[45]。

3 小 結(jié)

對CDK5的特性和功能以及CDK5在疾病治療中的研究已取得一些成果。CDK5作為特殊的CDK蛋白，與多個(gè)系統(tǒng)、多種疾病的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。CDK5通過與部分蛋白因子相互作用影響多種蛋白信號通路，且這些因子間有密切聯(lián)系。CDK5抑制劑在疾病研究中已被證實(shí)可發(fā)揮良性作用，并有部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。但目前有關(guān)CDK5的研究相對較少，研究時(shí)間尚短，且在不同實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)論尚不能肯定能發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi)，很多分子間相互作用的機(jī)制也不十分明確。因此，應(yīng)對CDK5的生理功能，尤其是作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，應(yīng)充分借助現(xiàn)代生化技術(shù)，多途徑、多靶點(diǎn)系統(tǒng)研究，從而有力促進(jìn)人類健康。