實驗動物腦出血模型的研究進(jìn)展

鄭嘉榮，鄧劍玲

(河北燕達(dá)醫(yī)院功能科，河北 廊坊 065201)

腦出血指原發(fā)性非外傷引起的腦實質(zhì)內(nèi)微血管破裂出血，是腦血管類疾病中發(fā)病急、病情重、致殘和致死率高的疾病，但目前的醫(yī)療水平對其治療手段仍較少[1]。新生兒尤其是早產(chǎn)兒由于腦組織疏松、腦血管發(fā)育不完善、腦組織缺血缺氧及其他物理、化學(xué)因素造成新生兒生發(fā)基質(zhì)層腦血管破裂出血，嚴(yán)重的出血可導(dǎo)致新生兒各種神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失；而成人腦出血常發(fā)生于40歲以上人群，見于高血壓、糖尿病及血管畸形等原因[2]。近年來腦出血有年輕化趨勢，且病因更趨向于多樣化，其發(fā)病占我國腦卒中人群的20%～30%[3]。腦出血患者于發(fā)病后仍有繼續(xù)出血的現(xiàn)象，并導(dǎo)致病情加重。血腫不僅對腦組織形成壓迫，血腫內(nèi)分解釋放多種活性物質(zhì)也對腦組織有損害作用，加劇了后期病變嚴(yán)重化。因此，探索新生兒及成人腦出血發(fā)病原因、發(fā)病機制、病理生理變化對臨床預(yù)防和治療至關(guān)重要。建立可切實模擬人類腦出血機制和病理生理變化、穩(wěn)定性好、可重復(fù)性好的動物模型成為必要的選擇。近年來國內(nèi)外許多實驗組建立了多種實驗動物腦出血模型，但各類模型仍存在一定的缺陷，無法完全模仿人類腦出血的病理生理變化。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，為了克服單一方法建模的缺點，各種復(fù)合方法不斷出現(xiàn)，更接近人類腦出血病理生理過程，且更簡便、易行。而在實際工作中，常根據(jù)實驗的目的以及建模者對各種方法的熟悉程度來選擇理想的建模方法?，F(xiàn)就目前常見的幾類腦出血動物模型制備的技術(shù)和方法、優(yōu)缺點及應(yīng)用情況進(jìn)行總結(jié)。

1 動物種類的選擇

早期為了更好地模擬人類腦出血病理生理過程，曾選擇靈長類動物建模[4]，此類動物無論從解剖結(jié)構(gòu)還是生理功能方面均與人類相似，但由于此類動物不易獲得、造價昂貴，倫理接受度差，逐漸被棄用。隨后又相繼出現(xiàn)犬、貓等動物模型，這兩種動物用做實驗普及性差，不易控制，也逐漸棄用。目前動物腦出血模型多選取嚙齒類動物，常見的有大鼠[5-6]、家兔[7]。選擇大鼠、家兔作為最常用實驗動物的優(yōu)勢是價格低廉、容易飼養(yǎng)，可以選取大樣本實驗，實驗數(shù)據(jù)較可靠，且兩種動物腦解剖和生理比較接近人類且形體較小，可控性強，易于觀察大腦的生理病理變化；另外，各學(xué)科動物實驗多用大鼠，因此也積累了更多的實驗資料，各實驗室數(shù)據(jù)對比較容易。人類腦出血的常見位置為尾狀核，而大鼠的尾狀核是腦內(nèi)最大核團，較易觀察，所以用大鼠制作腦出血模型能較好地模擬人類腦出血部位。近年來，小鼠的腦出血模型研究取得一定進(jìn)展?？傊?，良好的動物模型應(yīng)具備以下條件：①良好的可控性，即出血的時間、范圍、部位可控；②與其相關(guān)因素(血壓、血氣、血糖等)可被密切觀察或控制；③可避免其他疾病和腦血管解剖差異性影響[8]。

2 腦出血模型建立的方法

腦出血建模方法包括膠原酶注入法、自體血局部注入法、自發(fā)性腦出血法、微球囊充脹法及高鹽誘導(dǎo)法。

2.1膠原酶注入法 該方法應(yīng)用膠原酶溶解血管內(nèi)皮下基膜層和細(xì)胞間基質(zhì)的膠原，造成血管壁破壞，從而造成腦出血。膠原酶本質(zhì)是一種金屬蛋白酶，存在于人體腦血管的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，病理情況下可釋放。膠原酶分為多型，目前研究認(rèn)為Ⅳ型和Ⅶ型用于腦出血建模最恰當(dāng)[5,9]。Rosenberg等[5]建立的膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型已被廣泛采用，將SD大鼠麻醉消毒后固定，顱骨轉(zhuǎn)孔，使用立體定位儀定位大鼠腦一側(cè)尾狀核，將微量注射器針頭插入腦組織尾狀核，分別分組注入0.01～1.0 μL膠原酶，連續(xù)觀察10 min后即可見發(fā)生出血，且出血后癥狀明顯、持續(xù)時間較長。實驗中發(fā)現(xiàn)不同劑量組致死率均較0.5 μL劑量組高，0.5 μL劑量成為最安全劑量。該方法建模的優(yōu)點是方法簡單、快捷、成功率較高，出血穩(wěn)定性好，并可多次重復(fù)；其能較好地模擬人體腦血管自發(fā)出血的生理生化過程以及出血后血腫持續(xù)擴大的病理變化過程。該方法適用于評估腦出血后各類指標(biāo)的長期觀察，但缺點是膠原酶并不能造成血管的物理性破裂，實際上是造成了小血管的廣泛慢性滲血，形成的血液滲出灶并不是真正意義上的局限的血腫，急性占位效應(yīng)不明顯，與人類腦出血的病理過程仍有區(qū)別[6，10]。另外，膠原酶本身可造成腦組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并且對血管有廣泛的破壞作用，這些不良作用可對腦出血后單純由血腫形成的炎癥反應(yīng)研究產(chǎn)生干擾[11]。另外，膠原酶對腦組織有細(xì)胞毒性作用，可嚴(yán)重?fù)p傷神經(jīng)功能及血腦屏障，因此并不能完全模擬人類單純腦出血后二次損傷的病理生理狀態(tài)，不能用來研究腦出血后血腫周圍組織血液循環(huán)障礙，有一定的局限性。

2.2自體血局部注入法 該方法是抽取動物自身一定量血液通過定位技術(shù)注入該動物腦尾狀核造成該部位血腫的一種建模方法。麻醉并固定動物后，動物顱骨局部轉(zhuǎn)孔，取選定腦組織局部注射動物非肝素化自體血，注血量與動物腦組織大小相關(guān)。Ropper和Zervas[12]最早使用此方法，采用供體鼠的腦室血快速注入受體鼠的大腦尾狀核內(nèi)形成血腫，取得了一定成功，但不足之處是血液注射壓力難以控制，供血常從針道反流，血腫量不易控制；嚴(yán)格來說Ropper和Zervas[12]的方法并非自體血。Nath等[13]于大鼠腦內(nèi)注入25、50、100 μL的大鼠自體血，模擬出血量為20、40、80 mL的狀態(tài)，取得一定成功，但仍不能避免針道反流。其后，多個實驗組對針道反流，壓力難控的問題進(jìn)行了改進(jìn)，包括多次小劑量注射、延長注射時間、減慢注射速率，多種方法的使用有效地減少了針道反流現(xiàn)象，也避免了血液進(jìn)入腦室和蛛網(wǎng)膜下腔。如Ropper和Zervas[12]和Xi等[14]提出的二次、三次注血法較以往研究[13]均有效地減少了針道反流的血量，較好地控制了血腫的大小、形態(tài)及部位。自體血注入模型可觀察自體血注入腦組織后凝固過程中釋放血管活性物質(zhì)對腦組織的毒性作用，與臨床出血病理生理過程一致。自體血常取材于實驗動物的內(nèi)眥[15]、股動脈[16]、心臟[17]等處。內(nèi)眥取血血液標(biāo)本不易被污染，但取血為靜脈血，與腦動脈出血的血液成分不符。動脈穿刺法血液成分與腦出血成分較一致。但股動脈穿刺法操作較復(fù)雜，成功率低。心臟穿刺法同樣可以得到純凈的動脈血，操作較簡便，損傷較小，但對操作人員技術(shù)要求較高，需熟練的操作技巧，反復(fù)穿刺動物又容易導(dǎo)致動物失血、感染死亡。改進(jìn)后的自體血注入方法具有血腫大小可控、操作相對簡便的特點，并且可以觀察血液凝固過程中局部腦組織的病理生理變化，此方法與人腦出血后演進(jìn)過程基本相似，可用于研究腦水腫機制及臨床藥物作用機制。該方法的缺點是注入腦內(nèi)的血腫并非血管破裂造成的。血液注射過程中不可避免地有反溢現(xiàn)象和血液凝固堵塞針道的問題，血腫形態(tài)和大小重復(fù)性差。

2.3自發(fā)性腦出血法 高血壓是人類腦血管病腦出血較常見的病理基礎(chǔ)，因此，培育高血壓大鼠，促進(jìn)其腦血管自發(fā)破裂是最接近人類腦出血病理生理變化的一種動物模型。目前有實驗采用基因培育方法培育出具有易出血的高血壓基因動物，該動物自出生起數(shù)周開始血壓自發(fā)升高，短時間內(nèi)可發(fā)生自發(fā)性腦出血[18]。這類動物也常用大鼠，是在已有高血壓基因大鼠的基礎(chǔ)上近親繁殖培育，其相對于祖代血壓更高，自發(fā)性腦出血發(fā)生率達(dá)80%，發(fā)生出血的部位主要在大腦前內(nèi)側(cè)皮質(zhì)、枕皮質(zhì)和基底節(jié)[19]。此模型是研究成人型腦出血較理想的模型。其優(yōu)點在于將高血壓與腦卒中結(jié)合，相似度極高地模擬人腦卒中病理，缺點是這類動物只代表腦出血的一小部分原因——高血壓，且動物培養(yǎng)成本高昂，繁育時間較長，動物體弱飼養(yǎng)困難，繁育的后代模型容易出現(xiàn)斷種、變種、基因突變的情況，應(yīng)用受到一定限制。近年來也有采用實驗動物雙腎動脈夾閉的方法制造高血壓模型，使之具備與臨床高血壓相似的腦出血病理基礎(chǔ)[20]。此模型較易制作，不存在遺傳變異的問題，雖然該模型不斷被改進(jìn)，但仍存在腦出血發(fā)生率低、腦出血量不易控制、出血區(qū)域不可估計等問題，使用受到一定限制。

2.4微球囊充脹法 此方法是基于研究血腫的力學(xué)破壞性而建立的模型，其核心方法是于腦組織中直接插入微球囊，模擬血腫對周圍腦組織的機械壓迫作用。Sinar等[21]先將大鼠顱骨特定部位轉(zhuǎn)孔，然后將固定在針頭部位的微球囊通過該孔插入大腦尾狀核頭部，在20 s內(nèi)注入微球囊50 mL液體，保留10 min，觀察微球囊對腦組織的壓迫作用，然后回抽微球囊內(nèi)液體，通過不斷變化微球囊體積模擬不同大小血腫對腦組織的壓迫作用。該方法簡便易行，可人為控制血腫壓迫范圍，也避免了血腫破入腦室而不能控制其范圍。后期又有研究對此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將微球囊內(nèi)液體改為氣體，可以快速充放，模擬腦血腫形成并清除的過程，觀察血腫的壓迫效應(yīng)與血腫清除后腦組織恢復(fù)過程[22]。但此模型仍存在一定的缺點。微球囊并非血液成分，并沒有考慮腦出血后血腫的血液成分對腦組織的細(xì)胞毒性作用，出血后期，血腫中的血液成分對腦組織的破壞作用是相較于壓迫更為復(fù)雜的病理過程，目前的研究雖然較多，但其原理仍無法解釋。血腫的腦細(xì)胞毒性作用的研究是人類需要解決的重要問題，因此近年來的腦出血研究基本上以摒棄了此方法。

2.5高鹽誘導(dǎo)法 高鹽高鈉的攝入仍是比較確定的高血壓發(fā)病的機制之一。高鹽攝入不僅可以使血管滲透壓增高、血容量增加、血管壁物理壓力增大，而且可使腦血管壁結(jié)構(gòu)及腦血管內(nèi)皮緊密連接被破壞。研究表明，高鹽高鈉攝入的動物腦血管性血友病因子及連接蛋白表達(dá)降低，血管脆性增加，多種因素促進(jìn)了腦血管的破裂出血[23]。但目前也存在一些爭議，認(rèn)為高鹽造成的腦出血更多的是因為氯化鈉對腦血管的直接破壞作用[24]。而該方法模擬人體高鹽飲食觸發(fā)高血壓疾病的病理生理過程，給予實驗動物及原有高血壓基因的動物以高鹽飲食喂養(yǎng)，每周測量一次尾動脈收縮壓，數(shù)周后形成高血壓動物，觀察大鼠行為學(xué)改變并進(jìn)行神經(jīng)功能評分，據(jù)此判定其是否腦受損、出血[23]。結(jié)果表明，此模型大鼠腦出血血管壁受損、破裂，出現(xiàn)的血腫體積小且為散在多發(fā)，出血部位腦組織均有微小碎裂，與人類高血壓腦出血發(fā)病機制相似，并可研究高鹽攝入對腦血管的損傷機制，理論上可靠性較強。但缺點是建模時間較長，不穩(wěn)定，出血量及出血時間不易控制，研究及時性差。同時，此模型只代表一類出血機制，使用范圍較窄。

2.6其他方法 由于以上幾種方法均有一定缺點，各研究小組利用膠原酶、自體血、凝血酶及肝素等協(xié)同誘導(dǎo)加強的作用[25-26]制作復(fù)合型腦出血模型[27-28]，如膠原酶與自體血混合注入誘導(dǎo)腦出血模型[29]，自體血加肝素注入腦出血模型[30]以及膠原酶加肝素建模[31]，甚至還有遺傳高血壓大鼠加自體血注入的方法[32]。隨著影像、計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，有學(xué)者使用超聲、數(shù)字減影腦血管造影引導(dǎo)下的穿刺建模方法[33-34]也取得一定成功。

3 小 結(jié)

無論哪種方法建立動物腦出血模型均存在各自的優(yōu)缺點。膠原酶及自體血注入法建模方法簡便易行，制作上有很多相似之處，可重復(fù)性好，比較穩(wěn)定，是較廣泛使用的方法。MacLellan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，自體血注入法形成的腦血腫吸收更快、更完全，對腦組織的損傷較膠原酶注入法更小，對血腦屏障幾乎沒有損傷，大鼠的神經(jīng)功能障礙更容易恢復(fù)。MacLellan等[35]的實驗也指出以上兩種建模方法均無法完全復(fù)制人類腦出血情況。微球囊充脹法由于明顯的局限性目前幾乎已不被使用。自發(fā)性腦出血及高鹽誘導(dǎo)腦出血因難于控制血腫量、出血部位和出血時間，相對于膠原酶法和自體血法已較少使用。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及各種新技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的腦出血建模方法不斷出現(xiàn)，但仍有缺陷，需要不斷的研究和改進(jìn)。建立標(biāo)準(zhǔn)化腦出血動物模型已成為研究者共同追求的目標(biāo)，建模過程的各處理因素和影響因素統(tǒng)一化，減少對實驗結(jié)果的影響，盡可能與人類腦出血的發(fā)病過程、病理生理過程趨向一致將是一個長期探索的過程。