外泌體在腎纖維化中的研究進(jìn)展

趙勝，周向軍，程帆

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，武漢430000)

慢性腎臟病是對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅的常見疾病，發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。腎纖維化是慢性腎臟病終末期不可逆的病理改變，是臨床醫(yī)務(wù)工作者面臨的十分棘手的問題。針對(duì)腎纖維化雖然已經(jīng)有大量的科學(xué)研究，但目前仍不能完全解釋腎纖維化具體的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。1983年外泌體被首次發(fā)現(xiàn)[1]，截至目前已經(jīng)證實(shí)多種類型的細(xì)胞均可分泌外泌體，包括血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胚胎細(xì)胞甚至腫瘤細(xì)胞等[2-3]。起初，科研工作者認(rèn)為外泌體僅僅是細(xì)胞處理胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的一種方式，并未給予足夠重視，隨著對(duì)外泌體研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體發(fā)揮著非常重要的生物學(xué)功能。外泌體的功能與腎纖維化的發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系值得進(jìn)一步探究。近年來隨著外泌體在腎臟病領(lǐng)域研究的迅速發(fā)展，臨床以及基礎(chǔ)的科學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)外泌體與腎臟纖維化密切相關(guān)[4]?，F(xiàn)就外泌體的基本特點(diǎn)以及外泌體在腎臟纖維化中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的物質(zhì)組成及功能 細(xì)胞外囊泡可以根據(jù)囊泡的大小、組成成分及生物學(xué)功能分為三大類，即細(xì)胞微粒、外泌體和凋亡小體[5]。其中外泌體是一類直徑40～100 nm的細(xì)胞外囊泡，主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等構(gòu)成。脂質(zhì)構(gòu)成了外泌體的膜，與細(xì)胞膜類似，富含膽固醇、鞘磷脂等，起到穩(wěn)定外泌體結(jié)構(gòu)的作用。外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)成分包括CD63、CD9、Alix和TSG101等，這些蛋白被認(rèn)為是鑒定外泌體相對(duì)特異性的標(biāo)志物[6-8]。此外，特定細(xì)胞分泌的外泌體也可能含有特定的蛋白質(zhì)，如腎小管上皮細(xì)胞分泌的外泌體含有CD24、集合管上皮細(xì)胞分泌的外泌體含有水通道蛋白2等[9-10]。外泌體內(nèi)的核酸包括信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA)等，這些核酸物質(zhì)抵達(dá)受體細(xì)胞后可以直接參與受體細(xì)胞某些基因蛋白質(zhì)的編碼或者干預(yù)某些基因蛋白的編碼，從而改變相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)揮其特定的生物學(xué)作用[11-12]。

1.2外泌體的分泌以及與靶細(xì)胞的結(jié)合 外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，在生物體內(nèi)廣泛存在于尿液、血液等各種體液中[13]。被組織細(xì)胞釋放的外泌體可以隨著體液抵達(dá)受體細(xì)胞，并通過三種不同的機(jī)制與受體細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮作用：①外泌體膜表面特定蛋白與靶細(xì)胞膜表面特異性黏附分子及受體結(jié)合(無膜融合的發(fā)生)，活化受體及下游信號(hào)通路，從而達(dá)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的；②外泌體膜與受體細(xì)胞膜直接融合后，將外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸物質(zhì)等傳遞至靶細(xì)胞；③靶細(xì)胞通過內(nèi)吞作用直接攝取外泌體，然后通過與胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)融合完成物質(zhì)傳遞或者通過溶酶體進(jìn)行降解[14]。

1.3外泌體的分離提取及鑒定 外泌體的分離純化一直受到科研工作者的關(guān)注，獲得高純度的外泌體對(duì)后續(xù)的研究至關(guān)重要。由于提取外泌體的技術(shù)尚不成熟，各種方法各有優(yōu)劣，所以尚無明確的最可靠的外泌體提取方法。目前比較常用的提取外泌體的方法主要包括：超速離心法，其最常用且獲得的囊泡數(shù)量多，但操作耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)設(shè)備要求高，需要超速離心機(jī)[15]；密度梯度離心法，通過超速離心力的作用將外泌體富集于不同密度梯度的蔗糖溶液中，此法獲得外泌體純度很高，但產(chǎn)量較低，且步驟相對(duì)繁瑣[16]；磁珠免疫法，用包被抗標(biāo)志物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，將外泌體吸附并分離出來[17]。近年來，商業(yè)化試劑盒的推廣成為外泌體分離的主流手段，試劑盒提取外泌體的方法操作簡便，純度可靠，但價(jià)格較昂貴。此外，還有超濾離心法、exoEasy親和性膜離心柱法、多聚物沉淀法等多種外泌體提取方法，但實(shí)際應(yīng)用較少[18]。外泌體鑒定方法主要有納米顆粒跟蹤分析技術(shù)、透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)以及蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)[19-20]，一般外泌體的鑒定至少需要同時(shí)使用2～3種方法。

2 外泌體與腎纖維化的關(guān)系

腎纖維化是多種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的主要病理改變和共同通路，以腎間質(zhì)過量細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞以及功能喪失為特征[21]。腎纖維化的具體病理機(jī)制為：在各種致病因素(炎癥、創(chuàng)傷、代謝紊亂等)的作用下，基質(zhì)蛋白的合成增加而降解減少，引起細(xì)胞外基質(zhì)在腎實(shí)質(zhì)內(nèi)大量沉積，最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化以及腎內(nèi)血管硬化[22]。腎纖維化會(huì)導(dǎo)致腎功能喪失，最終引起慢性腎衰竭，因而深入研究腎纖維化的機(jī)制尤為重要。目前的研究發(fā)現(xiàn)，多種腎臟損傷因素(腎積水、缺血再灌注損傷、化療藥物等)或腎臟疾病(糖尿病、IgA腎病、狼瘡性腎炎等)會(huì)導(dǎo)致纖維化的發(fā)生，其分子機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多方面，多種細(xì)胞信號(hào)分子及通路參與了腎纖維化的進(jìn)程[23]。

外泌體是近年來研究的熱點(diǎn)，其作為細(xì)胞間重要的通訊載體，能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛影響機(jī)體的病理生理過程。目前的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與了包括腎纖維化在內(nèi)的多種疾病的病理生理過程，同時(shí)在各種原因?qū)е碌哪I纖維化中扮演著重要角色[24-25]。

2.1外泌體與腎積水導(dǎo)致的腎纖維化 在臨床工作中，腎積水是導(dǎo)致腎纖維化最常見的原因之一[26]；另外，在科研工作中，單側(cè)輸尿管梗阻導(dǎo)致腎積水也是構(gòu)建腎纖維化模型的重要方法[27]。首先，外泌體及其內(nèi)容物在腎積水導(dǎo)致的腎纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。Furini等[28]采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立的小鼠腎纖維化模型中，腎組織中谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶-2(transglutaminase-2，TG2)蛋白的表達(dá)量顯著升高，而剔除TG2基因后，小鼠腎纖維化程度明顯減輕；后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌富含TG2蛋白的外泌體，而應(yīng)用外泌體分泌抑制劑GW4869可顯著抑制細(xì)胞上清中TG2的含量，該研究結(jié)果證明，TG2通過外泌體被腎小管上皮細(xì)胞分泌至胞外，從而發(fā)揮促纖維化作用。Borges等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，積水腎臟皮質(zhì)富含外泌體，該外泌體內(nèi)富含TGF-β1蛋白對(duì)應(yīng)的信使RNA，然后該外泌體被靶細(xì)胞攝取，從而促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。以上研究證明，腎小管上皮細(xì)胞可分泌具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)或信使RNA的外泌體，并靶向作用于受體細(xì)胞，從而引起纖維化的發(fā)生。

此外，外泌體內(nèi)另一重要成分miRNA，也可能在積水所致腎纖維化中發(fā)揮作用。Zhou等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，促纖維化因子TGF-β1可刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌富含miR-21的外泌體，該外泌體可刺激正常腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過蛋白激酶B/人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展。以上新的研究加深了科研工作者對(duì)積水導(dǎo)致腎纖維化分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。其次，外泌體除了在積水導(dǎo)致腎臟纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮作用外，某些細(xì)胞在特定情況下產(chǎn)生的外泌體在積水腎纖維化中也起著重要的治療作用。在一項(xiàng)針對(duì)腎纖維化分子治療的研究中，Wang等[31]首先利用基因工程技術(shù)過表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中運(yùn)載的miR-let7c，然后將產(chǎn)生的外泌體通過靜脈注射入單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟纖維化程度較單純的輸尿管梗阻動(dòng)物模型明顯減輕，說明外泌體在積水腎纖維化中發(fā)揮治療作用，為腎積水導(dǎo)致的腎纖維化的預(yù)防和治療提供了新的思路?？傊?，腎積水是導(dǎo)致腎纖維化的重要原因之一，外泌體參與了腎積水導(dǎo)致的腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，并且在腎積水導(dǎo)致的腎纖維化的預(yù)防和治療中有一定的應(yīng)用前景。

2.2外泌體與腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎纖維化 腎缺血再灌注損傷是泌尿外科臨床工作者經(jīng)常面臨的問題，多種手術(shù)方式(腎部分切除術(shù)、腎移植術(shù)等)均會(huì)不可避免地造成腎缺血再灌注損傷。目前的研究證明，急性腎缺血再灌注損傷最終會(huì)導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生，其機(jī)制復(fù)雜，涉及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等多方面[32]。在一項(xiàng)動(dòng)物研究中，Cruzado等[33]通過夾閉大鼠單側(cè)腎蒂60 min建立了單側(cè)腎缺血再灌注損傷模型，16周后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟發(fā)生腎小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化。目前有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體與腎缺血再灌注損傷的關(guān)系密切，然而絕大多數(shù)研究是致力于外泌體在腎臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮的保護(hù)作用[34]。Dominguez等[35]研究發(fā)現(xiàn)，正常腎小管上皮細(xì)胞來源的外泌體能夠有效減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷，并促進(jìn)損傷后的修復(fù)。Lin等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠有效保護(hù)腎臟，減少缺血再灌注造成的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌大量富含miR-199a-5p的外泌體，并靶向作用于BIP(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells)基因，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而在早期減輕腎缺血再灌注損傷[37]。除保護(hù)作用外，外泌體在腎缺血再灌注損傷的早期診斷以及預(yù)后評(píng)估方面也發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，尿液中外泌體內(nèi)水通道蛋白1有望成為早期診斷腎缺血再灌注損傷的標(biāo)志物[38-39]。

目前雖然已經(jīng)有大量證據(jù)表明腎缺血再灌注損傷與外泌體密切相關(guān)，而且缺血再灌注損傷最終也可以導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生，但是僅有少數(shù)研究直接闡述了外泌體與缺血再灌注導(dǎo)致的腎纖維化的關(guān)系，可能與缺血再灌注損傷引起腎纖維化的模型周期相對(duì)較長有關(guān)。有研究報(bào)道，缺氧可刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌富含TGF-β1蛋白信使RNA的外泌體，從中提取到的外泌體可有效刺激成纖維細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮促進(jìn)纖維化進(jìn)展的作用[29]。另有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以激活腎小管上皮細(xì)胞Sox9(SRY related high mobility group box gene 9)基因的表達(dá)，從而延緩缺血再灌注損傷后急性腎損傷向腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的過程[40]。這些研究可以深化人們對(duì)腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致腎纖維化機(jī)制的理解?？傊I缺血再灌注損傷最終可導(dǎo)致腎纖維化的發(fā)生，并可引起組織細(xì)胞分泌外泌體的改變，不同細(xì)胞來源的外泌體也可在一定程度上影響腎組織缺血再灌注損傷的程度，但具體機(jī)制尚需更多研究證實(shí)。

2.3外泌體與糖尿病導(dǎo)致的腎纖維化 糖尿病腎病作為慢性腎臟病的一種，是糖尿病患者最重要的合并癥之一[41-42]。此類患者一旦發(fā)生腎損害，將出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿、腎功能的持續(xù)性減退直至腎衰竭。然而，糖尿病腎病的早期診斷尚缺乏可靠的標(biāo)志物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，體液中的外泌體，尤其是尿液中外泌體的檢測可以作為早期診斷糖尿病腎病的重要方法,在糖尿病大鼠模型中，尿液中的外泌體內(nèi)有兩種蛋白的表達(dá)較正常尿液有顯著改變，其中脯氨酰氨基酸(二肽)酶表達(dá)顯著升高，而MUP-1(major urinary protein 1)表達(dá)顯著降低[43]。此外，Zubiri等[44]進(jìn)一步研究了糖尿病腎病患者與正常人尿液外泌體中352種蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AMBP(alpha-1-microglobulin/bikunin precursor)、KMT2C(lysine N-methyltransferase 2C)以及VDAC1(voltage-dependent anion-selective channel protein 1)的表達(dá)差異顯著。

除外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)外，外泌體中miRNA的表達(dá)量也有望成為糖尿病腎病早期診斷的重要部分。Barutta等[45]檢測了微量蛋白尿患者與正常人尿液外泌體中22種miRNA的表達(dá)，其中miR-130a和 miR-145在微量蛋白尿患者尿液外泌體中表達(dá)顯著升高，而miR-155和miR-424表達(dá)顯著降低；在糖尿病模型動(dòng)物的尿液外泌體中，miR-145的表達(dá)呈現(xiàn)出與之類似趨勢，除動(dòng)物模型外，體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞在高糖環(huán)境下也可分泌大量含miR-145的外泌體，因而研究者提出，外泌體中miR-145的含量與糖尿病腎病密切相關(guān)，因此糖尿病患者尿液中外泌體內(nèi)的成分分析有望成為糖尿病腎損害早期診斷的新策略。

除診斷作用外，外泌體也參與了糖尿病患者腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展。腎小球硬化是糖尿病腎病進(jìn)展至終末期的重要病理改變，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞以及足細(xì)胞作為腎小球主要的構(gòu)成部分，它們之間的信號(hào)交流可能發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，高糖可刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分泌外泌體，這些外泌體內(nèi)部含有TGF-β1的信使RNA，可被腎小球系膜細(xì)胞以及足細(xì)胞攝取，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而引起細(xì)胞功能紊亂[46-47]。此外，傳統(tǒng)中藥通心絡(luò)可有效抑制腎小球上皮細(xì)胞外泌體的分泌，降低纖維化的發(fā)生，這可能是通心絡(luò)治療糖尿病的重要機(jī)制之一[48]。外泌體在糖尿病腎臟纖維化的治療中也發(fā)揮重要作用。Jiang等[49]提取了尿源干細(xì)胞分泌的外泌體，并通過尾靜脈注射入糖尿病小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠蛋白尿減少，腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞凋亡減少，而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增殖力升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可通過調(diào)節(jié)自噬改善糖尿病大鼠腎臟纖維化程度[50]。以上研究表明，外源性外泌體在糖尿病腎病的治療中有一定的應(yīng)用潛能。

2.4外泌體與其他原因?qū)е碌哪I纖維化 IgA腎病是一種免疫失調(diào)、免疫復(fù)合物介導(dǎo)的原發(fā)性腎小球疾病，是中青年人群最常見的原發(fā)性腎小球疾?。焕钳徯阅I炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并的免疫性腎損傷，以上兩種疾病最終都可以導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。然而，目前此類患者的臨床診斷仍依賴于腎活檢，因而不可避免地會(huì)對(duì)患者造成較大損傷。Min等[51]的研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者相較正常者，尿液中外泌體內(nèi)的miR-215-5p和miR-378i表達(dá)顯著升高，而miR-29c和miR-205-5p表達(dá)顯著降低。Solé等[52]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c在狼瘡性腎炎患者尿液中外泌體內(nèi)的含量較健康對(duì)照者顯著升高。因而，外泌體內(nèi)這些指標(biāo)的變化為此類患者的無創(chuàng)診斷提供了新的思路。

高血壓腎病作為慢性腎臟病的病因之一，最終也會(huì)引起腎臟廣泛纖維化。一項(xiàng)針對(duì)高血壓腎病的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧刺激人體心肌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可有效改善高血壓大鼠模型腎臟炎癥反應(yīng)及組織纖維化的程度[53]，表明外泌體在高血壓導(dǎo)致的腎纖維化中的治療潛能。腎積水、缺血再灌注損傷以及糖尿病是導(dǎo)致腎纖維化最重要的原因，所以對(duì)于其他原因?qū)е碌哪I纖維化的研究相對(duì)較少，有關(guān)外泌體的研究更少，僅有的一些研究僅僅局限于外泌體在其中發(fā)揮的診斷作用，對(duì)于機(jī)制的相關(guān)研究尚待探索。

3 小 結(jié)

外泌體是目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)，多種病因?qū)е碌哪I臟纖維化與外泌體密切相關(guān)。首先，外泌體內(nèi)的多種成分(如蛋白質(zhì)、miRNA等)可作為腎臟纖維化的診斷標(biāo)志物，也是目前研究較多的領(lǐng)域；其次，不同的組織細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可通過不同的機(jī)制影響腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展；最后，多種干細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)不同的有效成分可一定程度上對(duì)腎纖維化起到治療作用。目前，關(guān)于外泌體與腎纖維化關(guān)系的研究仍處于初級(jí)階段，外泌體從細(xì)胞中釋放的具體過程、機(jī)制、作用于受體細(xì)胞的方式以及引起纖維化改變的具體靶點(diǎn)等仍未明確。針對(duì)以上各方面的研究可以深化人們對(duì)外泌體以及腎纖維化的認(rèn)識(shí)，并有助于在腎纖維化的治療中獲得新的發(fā)現(xiàn)。