糖尿病腎病和miRNA相關(guān)性的研究進(jìn)展

宋 鑫 劉云啟

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，山東省濱州市 256603

糖尿病是一種異常的代謝性疾病，糖尿病患者數(shù)量的持續(xù)增長以及其并發(fā)癥即DN的出現(xiàn)終將對個(gè)人及家庭經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生巨大的負(fù)擔(dān)，而目前尚無法提前預(yù)測DN的出現(xiàn)及有效治愈DN。當(dāng)前臨床工作中，DN是根據(jù)患者臨床癥狀及尿的化驗(yàn)進(jìn)行常規(guī)診斷的，例如蛋白尿，范圍從微量白蛋白尿(30～300mg/d)到大量白蛋白尿(≥350mg/d)。然而，蛋白尿的發(fā)生也可以出現(xiàn)在其他腎臟疾病中，如膜性腎病，因此我們無法得知糖尿病患者出現(xiàn)了蛋白尿是并發(fā)了DN還是單純的糖尿病合并其他腎臟疾病，這也說明尿蛋白、eGFR等檢查在診斷DN方面的敏感性和特異性較差。因此發(fā)現(xiàn)能夠?qū)N進(jìn)行早期診斷，盡早評估腎臟損傷程度的新型生物標(biāo)志物對于減少人類慢性腎臟疾病的負(fù)擔(dān)是極其重要的。在DN的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，發(fā)現(xiàn)miRNA與內(nèi)皮細(xì)胞和心血管功能障礙相關(guān)。因此，miRNA符合用作診斷糖尿病及其血管并發(fā)癥的生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)。

1 DN介紹

DN是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，主要是以腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞纖維化和凋亡為病理特征，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)腎小球結(jié)構(gòu)和功能的異常。根據(jù)DN的病程及生理演變過程，可分為5期，早期主要表現(xiàn)是微量白蛋白尿，容易被忽視。通常于第4期出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn)，如鈉水潴留導(dǎo)致肢體腫脹、大量蛋白尿及因血液中低氧導(dǎo)致的疲勞和惡心等癥狀。如不及時(shí)治療，就會進(jìn)展至第5期——ESRD，此時(shí)腎臟功能衰竭，有效的治療方法為腎透析或腎移植[1]。隨著糖尿病患病率的增加，透析患者中一半以上為DN，它與心血管死亡事件的高風(fēng)險(xiǎn)性息息相關(guān)。

2 miRNA介紹

自從1993年miRNA首次被Lee等人發(fā)現(xiàn)以來，至今為止已發(fā)現(xiàn)2000多種人類miRNA[2]。miRNA屬于非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)的一種，其成熟形式為單鏈RNA分子，長度為18～25個(gè)堿基，其序列在動(dòng)物物種中具有高度保守性。miRNA主要是通過降解信使RNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化和自噬等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，miRNA表達(dá)的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，如糖尿病及其并發(fā)癥(糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變)、心血管疾病(心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化)、腎臟疾病(腎纖維化、多囊腎)以及大多數(shù)癌癥[4-5]?，F(xiàn)就不同miRNA(miR-21、 miR-192、miR-451、miR-23b、miR-27、miR-R17)調(diào)節(jié)對DN的影響進(jìn)行綜述。

3 miRNA與糖尿病腎病

3.1 miR-21 研究表明miR-21通過靶向作用于腎組織的PTEN(磷酸酶和張力蛋白同源基因)和smad7促進(jìn)腎臟纖維化。另外發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-21可以下調(diào)smad7/p-smad7和上調(diào)smad3/p-smad3的表達(dá)來增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)，而通過抑制miR-21不僅能夠阻止EMT和腎纖維化的進(jìn)展，還能改善DN的腎臟結(jié)構(gòu)和功能[6]。Malte等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，在DN中miR-21集中存在于腎小球細(xì)胞，通過靶向細(xì)胞分裂周期25a和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-6能夠阻滯細(xì)胞周期并促進(jìn)系膜細(xì)胞(Mesangial cell，MC)肥大，還能通過調(diào)節(jié)PTEN導(dǎo)致足細(xì)胞功能障礙。這意味著抑制miR-21的表達(dá)可作為一種有效的治療手段來緩解DN腎臟纖維化。然而，Jennifer等人[8]的研究結(jié)果顯示，在DNA損傷和Tgfb1-TG小鼠模型中，miR-21的缺失可以加速腎小球損傷和足細(xì)胞凋亡，表明miR-21的表達(dá)在腎小球損傷中具有保護(hù)作用。他們的研究結(jié)論存在分歧可能與研究標(biāo)本不同、樣本量差異等因素有關(guān)，miR-21與DN之間的聯(lián)系還需要我們繼續(xù)進(jìn)行探究。

Wang等人[9]研究報(bào)道，在DN小鼠模型中，血清miR-21表達(dá)與尿微量白蛋白與尿肌酐比值(ACR)呈正相關(guān)，與肌酐清除率(Ccr)呈負(fù)相關(guān)，miR-21抑制劑不僅可以降低血清miR-21和ACR，還可以升高Ccr。同時(shí)，血清中的miR-21與腎組織中的變化趨勢相一致，直接檢測血清miR-21可以替代檢測腎組織miR-21。結(jié)果表明血清miR-21的變化可以間接反映腎臟功能，可以作為診斷DN的生物標(biāo)志物，同時(shí)抑制miR-21的表達(dá)也不失為一種治療DN的有效手段。

3.2 miR-192 高糖毒性下，腎臟缺乏自噬活性，使得腎臟細(xì)胞更易受到損傷。Supriya等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-192在DN的自噬過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。在DN小鼠模型中，miR-192的過表達(dá)可以抑制小鼠腎小球MC中的自噬，用LNA-anti-miR-192寡核苷酸抑制miR-192的表達(dá)或敲除miR-192可逆轉(zhuǎn)其對自噬的抑制以及減少腎小球MC肥大，這說明miR-192的過表達(dá)可以促進(jìn)DN的發(fā)展。Liu等人[11]在DN大鼠模型中觀察到miR-192的表達(dá)與早期生長反應(yīng)基因-1 (Egr-1)的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性，Egr-1可通過促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)、加速腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等多種途徑參與腎臟纖維化。他們推測miR-192可能在DN進(jìn)展中起到啟動(dòng)子的作用，通過負(fù)調(diào)控Egr1的表達(dá)從而延緩腎小管間質(zhì)纖維化(Tubular interstitial fibrosis，TIF)的進(jìn)展。他們的發(fā)現(xiàn)表明miR-192在DN中具有腎臟保護(hù)作用。上述兩組人研究結(jié)果有所不同，這可能與miR-192在不同的動(dòng)物模型及細(xì)胞系中的差異性表達(dá)有關(guān)。

Yang等人[12]研究表明隨著DN的進(jìn)展，盡管miR-192在血清中的表達(dá)降低，但其在尿液中的表達(dá)卻是升高的。無論在血清還是尿液中，miR-192的AUC-ROC均高于ACR，并且ACR中的尿蛋白含量主要與腎小球硬化所致的濾過膜通透性增加有關(guān)，受人體內(nèi)總蛋白、器官功能、機(jī)體狀況和情緒等多種因素的影響，而血清和尿液中的miR-192則較穩(wěn)定，幾乎不被降解，這表明比起臨床上常用的檢測指標(biāo)ACR，miR-192能更好地評價(jià)腎臟損傷程度。

3.3 miR-451 Ywhaz編碼的蛋白屬于14-3-3蛋白家族，是一組高度保守的蛋白，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，它既是糖尿病相關(guān)基因，也是miR-451的靶基因。MAPK通路是公認(rèn)的糖尿病相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，它可以促進(jìn)炎癥和纖維化反應(yīng)，Ywhaz可刺激蘇氨酸/絲氨酸激酶raf1的活化，使MAPK磷酸化，引起細(xì)胞生長、分化、癌變[13-14]。miR-451可以通過mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)負(fù)調(diào)控Ywhaz的表達(dá)，進(jìn)而影響Ywhaz/MAPK信號傳導(dǎo)通路，下調(diào)MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白p-p38 MAPK和p-MKK3表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖[15]。因此，miR-451可能在DN的發(fā)病中起保護(hù)作用。大型多功能蛋白酶7(LMP7)是一種免疫蛋白酶體亞單位，可以激活核因子-κB(NF-κB)，而NF-κB的活化在DN的進(jìn)展中起重要作用。Sun等人[16]發(fā)現(xiàn)miR-451過表達(dá)可以直接抑制LMP7的表達(dá)從而抑制NF-κB的活化，進(jìn)而影響其與DN相關(guān)的促炎癥因子(如TNF-α、IL-18、MYD88、ICAM-1等)啟動(dòng)子結(jié)合，從而下調(diào)系膜細(xì)胞中促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在miR-451調(diào)控NF-κB活化的過程中，LMP7是一個(gè)不可缺少的中間作用因子，當(dāng)LMP7活性被抑制的時(shí)候，調(diào)節(jié)miR-451的表達(dá)并不能影響NF-κB的活化。這些結(jié)果表明miR-451可以通過調(diào)控LMP7/NF-κB通路在DN進(jìn)展中發(fā)揮作用[17]。

3.4 miR-23b Zhao等人[18]在DN小鼠中發(fā)現(xiàn)P53是miR-23b啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，通過抑制P53或上游的p38 MAPK可增強(qiáng)miR-23b的表達(dá)。GTP酶活化蛋白2(Ras GTPase-activating protein-binding protein 2，G3BP2)是miR-23b的作用靶點(diǎn)，通過抑制G3BP2的表達(dá)可觀察到miR-23b表達(dá)的增強(qiáng)以及P53和P38 MAPK表達(dá)的減少。他們推測高血糖可能是通過miR-23b/G3BP2反饋回路來抑制P53和P38 MAPK的表達(dá)，進(jìn)而參與DN的發(fā)病，而miR-23b發(fā)揮作用的主要機(jī)制是通過作用于P38 MAPK來減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白堆積所致的系膜擴(kuò)張。這些發(fā)現(xiàn)揭示了miR-23b在DN中的保護(hù)作用。有相關(guān)報(bào)道，TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程在DN腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起主導(dǎo)作用，而高遷移率族蛋白A2(High mobility group A2，HMGA2)則通過多種機(jī)制參與TGF-β1介導(dǎo)的EMT[19]。另外，研究[20]發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下的腎臟EMT與miR-23b的表達(dá)降低相關(guān)，而miR-23b高表達(dá)可以通過抑制HMGA2的表達(dá)來抑制PI3K/AKT信號通路的激活，進(jìn)而減弱糖尿病腎臟EMT，改善腎臟形態(tài)、腎臟纖維化和腎功能，并防止高血糖環(huán)境下DN的發(fā)生和發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)提供了miR-23b作為EMT抑制劑的證據(jù)，增加miR-23b的表達(dá)可能有助于DN的治療。

3.5 miR-25 Li等人[21]發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人近端腎小管上皮HK-2細(xì)胞中miR-25呈時(shí)間依賴性下降。miR-25過表達(dá)能減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生并抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以此來保護(hù)HK-2細(xì)胞，它的抗凋亡作用依賴于PTEN/AKT通路的激活。PTEN既是一個(gè)經(jīng)典的促凋亡基因，同時(shí)也是miR-25的一個(gè)直接和功能性靶標(biāo)，在DN患者的腎活檢組織樣本中可看到PTEN表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)的PTEN可以消除miR-25對ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的抑制作用，這說明PTEN的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-25對腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。他們的發(fā)現(xiàn)提示過表達(dá)miR-25可能有助于DN的治療。Liu等人[22]發(fā)現(xiàn)在DN小鼠中，miR-25過表達(dá)可通過抑制足細(xì)胞功能障礙和氧化應(yīng)激來減少蛋白尿和減弱腎小球纖維化，同時(shí)還能抑制RAS系統(tǒng)來降低腎性高血壓，并且這種對RAS系統(tǒng)的抑制作用并不是通過影響氧化應(yīng)激產(chǎn)生的。而在正常小鼠中抑制miR-25表達(dá)則會導(dǎo)致腎臟纖維化增加、足細(xì)胞塌陷、蛋白尿和高血壓，miR-25的過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這些不良表現(xiàn)。因此，從DN的治療角度來看，增強(qiáng)miR-25的表達(dá)是有利的。

3.6 miR-217 Sun等人[23]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的足細(xì)胞中miR-217表達(dá)增加，通過抑制miR-217的表達(dá)可減弱高糖對細(xì)胞活性的抑制作用，還能抑制細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生。在進(jìn)一步的研究中他們還發(fā)現(xiàn)PTEN在足細(xì)胞中是miR-217的作用靶點(diǎn)，可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活來增強(qiáng)自噬，進(jìn)而保護(hù)足細(xì)胞，而通過抑制miR-217的表達(dá)可增強(qiáng)PTEN介導(dǎo)的自噬，以此來改善高糖環(huán)境下的足細(xì)胞損傷和胰島素抵抗。上述研究發(fā)現(xiàn)表明通過抑制miR-217的表達(dá)可以對DN的發(fā)展起到阻礙作用，是一個(gè)潛在的DN治療靶點(diǎn)。

4 小結(jié)與展望

DN的進(jìn)展是一個(gè)長期過程，隨著病情的加重終會發(fā)展至尿毒癥，最終離不開透析治療。近年來，隨著人們對miRNA認(rèn)識的不斷加深，發(fā)現(xiàn)其在多種疾病包括DN中扮演著重要角色。由于miRNA在血液和尿液中都比較穩(wěn)定，因此通過檢測miRNA水平來診斷早期DN有較好的效果。同時(shí)，miRNA在DN發(fā)病中的作用機(jī)理也逐漸被我們所了解，它可以通過調(diào)控多種信號通路來影響DN的進(jìn)程，并且通過增強(qiáng)或抑制不同的miRNA的表達(dá)可以對DN的進(jìn)展起到阻礙作用。雖然目前對miRNA和DN關(guān)系的研究越來越深入，包括大量的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但miRNA在DN臨床方面應(yīng)用的研究仍處于初級階段，需要我們繼續(xù)去探索。