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    新型冠狀病毒引起的臨床相關(guān)疾病及其分子生物學(xué)檢測

    2020-02-15 21:28:51郭雅瓊
    檢驗醫(yī)學(xué)與臨床 2020年18期
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)核酸基因組

    郭雅瓊,張 笠,魯 彥

    1.西北民族大學(xué)直屬附屬醫(yī)院/甘肅省第二人民醫(yī)院檢驗科,甘肅蘭州 730000;2.中國人民解放軍96604部隊醫(yī)院檢驗科,甘肅蘭州 730000

    新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)潛伏期長,傳染性強,發(fā)病機制不明確,在臨床上極易引起呼吸困難、膿毒血癥、凝血功能障礙、急性呼吸窘迫綜合征等,同時還可引起心血管系統(tǒng)疾病等一系列合并癥狀,且尚無特效治療藥物[1]。由于SARS-CoV-2引起的疫情發(fā)展迅速,對于出現(xiàn)臨床癥狀及疑似患者進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的SARS-CoV-2核酸檢測及診斷顯得尤為重要。本文就SARS-CoV-2的基因結(jié)構(gòu)特點、分子生物學(xué)檢測及其引起的相關(guān)臨床疾病進(jìn)行了簡要介紹,以期為臨床診斷提供一定的參考依據(jù)。

    1 冠狀病毒

    冠狀病毒是目前已知最大的RNA病毒,其基因組是一種具有薄膜的單股正鏈RNA,具有典型的5′端帽結(jié)構(gòu)和3′端Poly(A)尾,屬于巢狀病毒目冠狀病毒科冠狀病毒亞科,該亞科包括4個屬:α、β、γ和δ冠狀病毒[2]。因其在電鏡下的形狀似皇冠,故命名為冠狀病毒。冠狀病毒感染可影響呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等,同時還可感染動物導(dǎo)致動物患病[3]。迄今為止,共發(fā)現(xiàn)7種冠狀病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2)可感染人類[1,4]。其中HCoV-229E和HCoV-NL63屬于α屬冠狀病毒,HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均為β屬冠狀病毒[5]。

    2 SARS-CoV-2

    2.1SARS-CoV-2的基因結(jié)構(gòu)特征 SARS-CoV-2是一種具有包膜,顆粒呈圓形或橢圓形的病毒,屬于β冠狀病毒屬[1,6]。SARS-CoV-2基因在同一條編碼鏈上有5個典型的開放讀碼框架(ORF),包括開放讀碼框架1ab多蛋白(ORF1ab,7096-aa)、刺突糖蛋白(S,1273-aa)、包膜蛋白(E,75-aa)、膜蛋白(222-aa)和核衣殼蛋白(N,419-aa)[7]。目前對于SARS-CoV-2核酸檢測主要針對ORF1ab、N基因、E基因這3個位點。研究表明,SARS-CoV-2基因組與2003年爆發(fā)的SARS-CoV基因組序列相似度達(dá)80%,與蝙蝠SARS-CoV ZC45具有更高的同源性(88%)[8-9]。

    2.2SARS-CoV-2的理化特性 SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感,56 ℃存活 30 min、75%乙醇、含氯消毒劑、乙醚、過氧乙酸、氯仿和紫外線等對該病毒均可有效滅活,氯己定滅活效果不佳[10]。此外有報道顯示室溫(22~25 ℃,濕度 40%~50%)下,SARS-CoV-2可存活5 d[11-13]。以上認(rèn)識多來自對SARS-CoV和MERS-CoV的研究。

    2.3SARS-CoV-2的流行病學(xué)特點 研究顯示,武漢早期確診的SARS-CoV-2感染患者有武漢市華南海鮮市場暴露史(68.3%)[4]。隨后發(fā)現(xiàn)部分SARS-CoV-2感染患者具有武漢旅居史及直接或間接接觸史,提示了人與人之間傳播的可能[11]。目前SARS-CoV-2感染出現(xiàn)家庭聚集性發(fā)病,同時出現(xiàn)部分醫(yī)務(wù)人員感染,主要以飛沫及接觸等方式在人群中傳播,少數(shù)經(jīng)氣溶膠與消化道傳播。

    3 SARS-CoV-2與臨床疾病

    3.1SARS-CoV-2與呼吸系統(tǒng)疾病 研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2主要通過皮膚黏膜、眼結(jié)膜等感染人體,侵入人體后,多侵犯人體呼吸道肺泡上皮細(xì)胞等[4,6]。體外分離培養(yǎng)研究顯示,SARS-CoV-2感染后至被檢出存在一定的窗口期,在人呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)約需96 h,而在VeroE6和Huh-7細(xì)胞系中需要6 d。ZHU等[6]通過對原因不明的嚴(yán)重肺炎患者的3份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行病毒基因組學(xué)研究,利用下一代測序、實時反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、細(xì)胞培養(yǎng)和電子顯微鏡在臨床標(biāo)本中首次檢測到了SARS-CoV-2。由此證實SARS-CoV-2感染人體后會引起新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)。

    COVID-19發(fā)病年齡集中在40~60歲,以男性、有基礎(chǔ)疾病者居多,也有兒童發(fā)病。臨床癥狀主要為發(fā)熱、干咳、乏力等,并逐漸出現(xiàn)氣短、呼吸困難,病情嚴(yán)重者可迅速發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥等多臟器功能衰竭,甚至死亡。有研究報道血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)在人體不同器官組織中表達(dá)水平并不相同,以肺泡和小腸上皮細(xì)胞表達(dá)水平尤為顯著[14]。XU等[1]通過研究認(rèn)為COVID-19的發(fā)病機制很可能是SARS-CoV-2感染人體后與呼吸道和肺組織中的ACE2受體結(jié)合后導(dǎo)致的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。劉映霞等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染患者的血漿血管緊張素Ⅱ水平明顯升高,且與病毒滴度和肺損傷程度呈線性相關(guān),提示SARS-CoV-2感染可能導(dǎo)致患者腎素-血管緊張素系統(tǒng)失衡,引起急性肺損傷。COVID-19明確的發(fā)病機制有待進(jìn)一步的大數(shù)據(jù)研究證實。

    3.2SARS-CoV-2與心血管系統(tǒng) HUANG 等[4]通過對早期41例COVID-19患者的研究發(fā)現(xiàn),12% COVID-19患者合并心肌損傷,提示SARS-CoV-2感染會引起心肌損傷,考慮可能與COVID-19患者體內(nèi)Th1與Th2反應(yīng)平衡被破壞有關(guān)。這與部分病例最初并無發(fā)熱、乏力等癥狀,而以心慌、胸悶等為臨床首發(fā)癥狀相符合。趙蕊等[16]通過對28例COVID-19患者分析發(fā)現(xiàn),在治療過程中患者出現(xiàn)心肌酶升高,尤其肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)升高最為明顯。ACE2在人體心血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中也有表達(dá)[14],因此推測SARS-CoV-2可能也通過ACE2受體結(jié)合引起一系列ACE2受體信號級聯(lián)反應(yīng),在心臟損傷中發(fā)揮作用[17]。此外,COVID-19伴隨癥狀也會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響,發(fā)熱可引起心率增快、心肌耗氧量增加、心排血量下降,從而可能誘發(fā)患者缺血加重或心力衰竭。持續(xù)的缺氧導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等一系列細(xì)胞損傷;低氧還會誘導(dǎo)炎性反應(yīng),導(dǎo)致組織進(jìn)一步缺血,可能會造成非冠狀動脈閉塞性心肌梗死[18]。此外,病毒也可能直接感染心肌細(xì)胞,造成病毒性心肌炎。

    3.3其他 少數(shù)病例出現(xiàn)輕度納差、乏力、精神差、惡心嘔吐、腹瀉、頭痛、結(jié)膜炎等癥狀[19],考慮與SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的其他器官或系統(tǒng)損傷有關(guān),目前仍有待臨床大樣本研究加以證實。

    4 SARS-CoV-2的分子生物學(xué)檢測

    SARS-CoV-2感染機體后,病毒RNA是最先能被檢測到的標(biāo)志物,而人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體(IgM、IgG)往往滯后于病毒核酸。因此,SARS-CoV-2核酸檢測仍然是目前COVID-19最主要的檢測方法。

    4.1實時熒光RT-PCR 實時熒光RT-PCR可從基因水平檢測病毒,因其靈敏度高,特異性強,快速簡便,成本較低,成為目前使用的主要確診方法。

    4.1.1標(biāo)本的選擇 李萍等[20]通過對呼吸道標(biāo)本核酸檢測陽性的患者的糞便、血清和尿液標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測,結(jié)果顯示糞便標(biāo)本SARS-CoV-2陽性,而血清和尿液標(biāo)本未檢出陽性結(jié)果。陳煒等[21]通過對 4 例COVID-19確診病例的咽拭子與痰標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測發(fā)現(xiàn),痰液標(biāo)本中病毒載量高于咽拭子標(biāo)本,提示在SARS-CoV-2感染病例的分子生物學(xué)檢測中痰標(biāo)本的檢測意義優(yōu)于咽拭子標(biāo)本。在《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案(試行第六版)》中核酸檢測的常用標(biāo)本除鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液外,還增加了糞便標(biāo)本,同時建議為了提高核酸檢測陽性,盡可能留取痰標(biāo)本進(jìn)行檢測。

    4.1.2標(biāo)本的滅活 由于SARS-CoV-2存在極強的傳染性,使得實驗室檢測人員感染的風(fēng)險大大增加,因此對于標(biāo)本進(jìn)行滅活處理可以在一定程度上降低感染風(fēng)險。《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案(試行第六版)》中提到,SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min和75%乙醇處理下會被滅活。陳培松等[22]通過回顧性分析2例SARS-CoV-2核酸檢測陽性患者的咽拭子標(biāo)本發(fā)現(xiàn),56 ℃ 30 min和75%乙醇滅活處理對SARS-CoV-2核酸檢測無明顯影響。但該研究樣本量少,后續(xù)還需大量SARS-CoV-2滅活后核酸檢測數(shù)據(jù)進(jìn)一步對該結(jié)果進(jìn)行驗證。

    4.1.3實時熒光RT-PCR檢測 目前國家批準(zhǔn)的產(chǎn)品對SARS-CoV-2的核酸檢測均是通過靶向特定區(qū)域,對病毒的ORF1ab、N基因、E基因這3個位點進(jìn)行熒光定量檢測。根據(jù)引物和探針的不同,分為單靶標(biāo)(ORF1ab)、雙靶標(biāo)(ORF1ab、N基因)、三靶標(biāo)(ORF1ab、N基因和E基因)檢測。由于SARS-CoV-2為RNA病毒,易降解,采集標(biāo)本時應(yīng)避免使用含RNA酶的儲存管。獲得患者標(biāo)本后,首先對標(biāo)本進(jìn)行核酸提取,提取后先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進(jìn)行擴增檢測,最后通過熒光定量PCR得到標(biāo)本Ct值,最終判斷患者標(biāo)本中是否含有SARS-CoV-2。具體操作參照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南(第二版)》[23]及《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》[24]等。

    4.1.4檢測結(jié)果判斷 要確認(rèn)一個病例為陽性,需滿足同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2的三靶標(biāo)或者雙靶標(biāo)特異性實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性。如受實驗室檢測試劑盒限制,只能做一個靶標(biāo)檢測,應(yīng)至少針對SARS-CoV-2最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域進(jìn)行檢測,兩份標(biāo)本(不同部位及不同類型)檢測均為陽性才能判讀為陽性結(jié)果。同時,陰性結(jié)果不能排除SARS-CoV-2感染,應(yīng)考慮實驗中導(dǎo)致假陰性的原因(標(biāo)本采集是否合格、采集時間是否準(zhǔn)確及時、標(biāo)本保存運輸及處理是否符合條件、是否處于方法學(xué)窗口期、實驗人員技術(shù)誤差、是否存在PCR抑制物等)[23],對原因進(jìn)行逐一排除。

    4.2基因測序技術(shù) 宏基因組二代測序法(mNGS)是以宏基因組為研究對象,直接利用高通量測序?qū)εR床標(biāo)本中的基因組進(jìn)行檢測,實現(xiàn)病原微生物的快速識別、性能鑒定、功能研究以及微生物間、微生物與環(huán)境間相互關(guān)系的研究[25]。CHEN等[25]通過 mNGS對COVID-19患者的肺泡灌洗液進(jìn)行快速檢測,檢出了SARS-CoV-2,并通過分析發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因組與蝙蝠SARS-CoV ZC45基因組具有高度同源性。相較于實時熒光 RT-PCR,mNGS既可以鑒定新的病毒株,也可用于檢測早期低病毒含量標(biāo)本,更能對實時熒光RT-PCR檢測可疑或灰區(qū)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。但目前大多數(shù)醫(yī)院缺乏測序設(shè)備,缺乏相關(guān)專業(yè)人員來協(xié)助測序結(jié)果的解讀,缺乏研發(fā)階段的流程和試劑配比的優(yōu)化,缺乏陽性和陰性參考品的設(shè)立以及初步預(yù)臨床試驗的支持;同時mNGS成本較高、檢測周期較長,故不適合于常規(guī)臨床檢測。

    4.3數(shù)字PCR(dPCR) dPCR是指通過將一個標(biāo)本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應(yīng)單元,每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板),在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴增,擴增后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。與傳統(tǒng)PCR相比,其采用絕對定量的方式,不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照標(biāo)本,直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù),具有更高的靈敏度、特異性、精確性,而且在極微量核酸標(biāo)本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達(dá)量微小差異鑒定方面具有優(yōu)勢。與RT-PCR相比,dPCR可檢測到單分子級別的靶標(biāo) DNA,甚至可以檢出0.001%以下的突變率,可快速檢出痕量病毒,為有效篩選病毒攜帶者提供了條件。但dPCR系統(tǒng)成本高,通量有限、操作繁瑣,使得臨床應(yīng)用受限。

    4.4其他檢測方法 目前,針對RNA病毒較成熟的核酸診斷技術(shù)還有反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)、依賴核酸序列擴增(NASBA)、基于 CRISPR/Cas 基因核酸檢測技術(shù)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)和基因芯片等,但尚未出現(xiàn)上述方法在SARS-CoV-2檢測中具體應(yīng)用的相關(guān)報道。

    5 小 結(jié)

    目前SARS-CoV-2尚無特效治療方法,主要的治療仍是對癥支持治療。但在疫苗研制的科研攻關(guān)應(yīng)急項目中并行安排了多條技術(shù)路線,包括滅活疫苗、mRNA疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗等并行推進(jìn),部分疫苗制劑已經(jīng)進(jìn)入動物實驗階段。雖然目前我國SARS-CoV-2感染的新增病例數(shù)逐漸減少,治愈病例數(shù)逐漸增加,但防控任務(wù)仍然艱巨,疫情防控各項措施仍需要嚴(yán)格落實,應(yīng)繼續(xù)控制傳染源、及時檢測、早期診斷、報告、隔離、支持性治療和及時發(fā)布疫情信息。對個人來說,良好的個人衛(wèi)生習(xí)慣、注意個人防護(hù)、室內(nèi)保持通風(fēng)等也均有助于預(yù)防SARS-CoV-2的感染。

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