環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

李曉偉,楊 偉,趙先進(jìn)

山西省長治市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,山西長治 046000

由結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是目前流行最廣的傳染性疾病，全球每年新發(fā)結(jié)核病患者800萬～1 000萬例，死于結(jié)核病的人數(shù)高達(dá)180萬例。所以，如何快速進(jìn)行臨床診斷是結(jié)核病防控的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)靈敏度較差，陽性檢出率低，容易漏診。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病最為直接和可靠的依據(jù)，但是培養(yǎng)周期長，不利于結(jié)核病的及時(shí)診斷和治療。NOTOMI等[1]于2000年提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，這是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在恒溫條件下即可快速完成核酸的擴(kuò)增，而且無需購置昂貴的核酸擴(kuò)增儀，操作過程簡單，不容易污染，近年來已得到廣泛的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2019年1月在本院感染性疾病科就診的295例疑似結(jié)核病患者為研究對象，其中男190例，女105例。

1.2儀器與試劑 顯微鏡(日本奧林巴斯)；低溫高速離心機(jī)(上海安亭飛鴿牌)；生物安全柜(上海復(fù)興醫(yī)學(xué)科技有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(日本榮研)；抗酸染色試劑(珠海貝索生物制劑公司)；LAMP試劑(日本榮研，批號:96002)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 囑患者清晨漱口，咳深部痰于一次性無菌杯中立即送檢，每人送檢2份或3份痰液標(biāo)本，隨機(jī)抽取一份，共295份痰標(biāo)本，進(jìn)行涂片抗酸染色并做LAMP試驗(yàn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和比對。

1.3.2痰涂片抗酸染色 涂片、染色、顯微鏡檢查操作參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃·痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》進(jìn)行。結(jié)核分枝桿菌涂片抗酸染色鏡檢報(bào)告方式：至少檢查300個(gè)視野未發(fā)現(xiàn)抗酸菌(-)，1～2個(gè)抗酸菌/300個(gè)視野為±，1～9個(gè)抗酸菌/100個(gè)視野為+，1～9個(gè)抗酸菌/10個(gè)視野為++，1～9個(gè)抗酸菌/視野為+++，>9個(gè)抗酸菌/視野為++++。

1.3.3LAMP試驗(yàn)

1.3.3.1DNA提取 試劑盒通過對標(biāo)本中所含的細(xì)菌進(jìn)行破碎處理，使其所含的核酸游離到溶液中，并將得到的溶液與吸附劑試劑管中的多孔介質(zhì)混合，把標(biāo)本中所含的阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)去除，再通過滴注蓋薄膜濾器，使核酸溶液被提取出來。

1.3.3.2LAMP擴(kuò)增 確認(rèn)恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀溫度已達(dá)到67 ℃，將反應(yīng)試管放入擴(kuò)增儀中，開始進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為40 min[2]。

1.3.3.3結(jié)果判讀 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)試管放在LF-160熒光目視檢測裝置上，從反應(yīng)試管的側(cè)面進(jìn)行觀察；在確認(rèn)陽性對照發(fā)出綠色熒光，陰性對照沒有發(fā)出熒光后，對所檢測標(biāo)本進(jìn)行判定，發(fā)出綠色熒光者為陽性，未發(fā)出熒光者為陰性。

1.3.4肺結(jié)核診斷原則 肺結(jié)核的診斷是以病原學(xué)(包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué))檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、相關(guān)的輔助檢查及鑒別診斷等，進(jìn)行綜合分析作出診斷，以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較痰涂片抗酸染色鏡檢法和LAMP的檢測效能，計(jì)算靈敏度和特異度，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各檢測方法與臨床診斷結(jié)果的一致性評價(jià)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≤0.40時(shí)，兩者一致性差；Kappa值>0.40～<0.75時(shí)，兩者中度一致；Kappa值≥0.75時(shí)，兩者一致性較高。

2 結(jié) 果

2.12種方法對結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率比較 在295例研究對象中，LAMP的陽性檢出率為51%(150/295)，顯著高于痰涂片抗酸染色法的17%(51/295)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.65，P<0.001)。

2.22種方法對結(jié)核分枝桿菌的檢測效能評價(jià) 在本院感染性疾病科就診的295例疑似結(jié)核病患者中，臨床診斷肺結(jié)核的患者為180例，非肺結(jié)核患者為115例。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片抗酸染色法靈敏度為28%(50/180)，特異度為99%(114/115)，陽性預(yù)測值為98%(50/51)，陰性預(yù)測值為53%(114/214)，Kappa值為0.17；LAMP檢測靈敏度為83%(149/180)，特異度為99%(114/115)，陽性預(yù)測值為99%(149/150)，陰性預(yù)測值為79%(114/145)，Kappa值為0.70。LAMP檢測的靈敏度顯著高于痰涂片抗酸染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.31，P<0.001)。

2.3LAMP在痰涂片抗酸染色陰性標(biāo)本中檢測結(jié)核分枝桿菌的效能評價(jià) 以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，在244例痰涂片抗酸染色陰性的標(biāo)本中，LAMP的陽性檢出率為40%，靈敏度為77%，特異度為99%，Kappa值為0.90。

3 討 論

目前，我國結(jié)核病防控形勢嚴(yán)峻，提高結(jié)核病的診斷及治療能力，對結(jié)核病的防治工作具有重要意義。傳統(tǒng)的檢測方法，雖然成本較低，但是靈敏度較低、特異性較差，檢測周期長、檢出率低，這些都限制了其診斷效能。LAMP作為一種快速分子檢測方法初步應(yīng)用于本省各級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，這對于提高本省的肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性檢出率具有重要意義[3]。

本研究結(jié)果顯示：以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的陽性檢出率為51%，明顯高于痰涂片抗酸染色法的17%，LAMP診斷肺結(jié)核的靈敏度(83%)顯著高于痰涂片抗酸染色法(28%)，這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。痰涂片抗酸染色主要是以典型的桿狀形態(tài)為病原學(xué)報(bào)告依據(jù)，因?yàn)榄h(huán)境和個(gè)體差異等因素影響,結(jié)核分枝桿菌形態(tài)呈現(xiàn)多樣化，球狀、短桿狀、絲狀、細(xì)胞壁缺陷的L型等,除了形態(tài)多樣化，檢驗(yàn)人員的識別能力，閱片的時(shí)間和范圍，染片的質(zhì)量等等都會影響結(jié)果的判讀，故可能出現(xiàn)假陰性的情況，靈敏度較低[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道痰標(biāo)本的細(xì)菌載量在5 000～10 000/mL時(shí)，涂片鏡檢才會報(bào)告陽性[5]。LAMP具有許多優(yōu)點(diǎn),使用高效的DNA聚合酶和2對引物，識別靶基因的6個(gè)不同區(qū)域，特異性強(qiáng),靈敏度高,檢測時(shí)間短,無需昂貴的核酸擴(kuò)增儀和檢測設(shè)備，在等溫條件下即可完成擴(kuò)增反應(yīng)[6-8]，產(chǎn)物易檢測，同時(shí)整個(gè)反應(yīng)始終在密閉的環(huán)境進(jìn)行，儀器自動判斷結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室交叉污染風(fēng)險(xiǎn)低，適用于基層醫(yī)院結(jié)核病的診斷[9]。

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP與臨床診斷結(jié)果中度一致(Kappa值=0.70)，痰涂片抗酸染色與臨床診斷結(jié)果一致性差(Kappa值=0.17)，由此可見，LAMP對結(jié)核病的診斷有著重要的意義。本研究表明，在痰涂片抗酸染色陰性的244例患者中，LAMP檢測的靈敏度和特異度分別是77%、99%，與臨床診斷結(jié)果相比，一致性較高(Kappa值=0.90)，在痰涂片抗酸染色陰性的患者中陽性檢出率達(dá)40%，比國內(nèi)報(bào)道LAMP對痰涂片抗酸染色陰性標(biāo)本的陽性檢出率在20%～30%的結(jié)果略高，以上數(shù)據(jù)提示LAMP對于檢測痰涂片抗酸染色陰性標(biāo)本肺結(jié)核患者也具有一定的技術(shù)優(yōu)勢[10]。

綜上所述，在診斷肺結(jié)核時(shí)，LAMP具有較高的應(yīng)用價(jià)值，陽性檢出率和靈敏度均明顯高于痰涂片抗酸染色，尤其在痰涂片抗酸染色陰性的結(jié)核病診斷中有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究具有標(biāo)本來源單一、樣本量少等局限性，可能在一定程度上對研究結(jié)果造成影響，在評估LAMP試驗(yàn)的臨床應(yīng)用價(jià)值時(shí)，還需增加樣本數(shù)量并進(jìn)一步研究。多種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用降低漏檢率和誤診率，才能有效診斷結(jié)核病。