實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)布魯菌方法的建立與評(píng)價(jià)

郄春花，劉曄華，劉亞敏，李 穎，崔軍文

1.天津市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300192；3.天津市第二人民醫(yī)院感染科，天津 300192；4.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384

布魯菌病是一種人畜共患病，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。為了控制和減少疾病在動(dòng)物之間的傳播以及傳染給人類的風(fēng)險(xiǎn)，需要對(duì)病原體進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。臨床上用于確診布魯菌病的方法主要依靠血液及骨髓的細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢查，由于布魯菌生長緩慢，細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)長，且受血清中抑菌物質(zhì)及抗生素的影響，難以達(dá)到早期診斷的目的[1]。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是NOTOMI等[2]開發(fā)的一種新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。LAMP不僅廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測(cè),而且具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),特別適合病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)[3]。本研究針對(duì)布魯菌屬保守基因OMP 25設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了一種實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(RealAmp)方法，該方法簡便、快速，以期實(shí)現(xiàn)布魯菌的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 實(shí)驗(yàn)用菌株如下：布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株豬種布魯菌S2由天津市動(dòng)物疫病控制中心李秀梅老師贈(zèng)送。16株布魯菌臨床分離株由天津市第二人民醫(yī)院微生物室保存。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212購自天津市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2儀器與試劑 恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Fluo-Gene為北京弗羅朗生物科技有限公司產(chǎn)品；RealAmp試劑盒購自北京弗羅朗生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；人血液基因組提取試劑盒購自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中布魯菌序列(No.AM694198.2)，針對(duì)布魯菌屬保守基因OMP 25，利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4套引物，每套引物由F3、B3、FIP、BIP、FB和LB組成。引物序列由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。LAMP引物的序列為F3：5′-CGT CGG CTA CGA CCT GAA-3′；B3：5′-ACC GGC CAG ATC ATA GTT CT-3′；FIP：5′-TCG TCC AAG CCG TTG TTA AGC TCC CGG TTA TGC CGT ACC T-3′；BIP：5′-GTG CCG GTC TCG AAG CCA AGT GTT GCC GTA CTG GGT GTA-3′；FB1：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG CC-3′；LB1：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB2：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG C-3′；LB2：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB3：5′-TGC GAA CCG GCA ATA CCA GC-3′;LB3：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB4：5′-CTG CGA ACC GGC AAT ACC AGC-3′；LB4：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′。

1.3.2細(xì)菌DNA模板的制備 向1.5 mL EP管中加入0.5 mL生理鹽水，然后用接種環(huán)在管壁上研磨成菌懸液，于80～90 ℃滅活30 min，12 000 r/min離心10 min后去掉上清液，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3RealAmp反應(yīng)體系 首先，將各引物分別配成工作液，F(xiàn)IP、BIP、F3、B3、FB、LB按照8∶8∶1∶1∶4∶4水平比混合成引物混合液。按照RealAmp試劑盒說明書配制RealAmp反應(yīng)體系。反應(yīng)過程在恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Fluo-Gene中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。以2 μL無菌蒸餾水為模板設(shè)置陰性對(duì)照。以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株豬種布魯菌S2的DNA為模板，按照RealAmp試劑盒說明書的要求設(shè)置反應(yīng)條件，比較4套引物的擴(kuò)增效率，選擇擴(kuò)增效率最高的引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4RealAmp檢測(cè)布魯菌的特異性驗(yàn)證 提取過夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株豬種布魯菌S2、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212的細(xì)菌DNA，取2 μL作為模板，分別進(jìn)行RealAmp反應(yīng)，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.3.5RealAmp檢測(cè)布魯菌的靈敏度實(shí)驗(yàn) 提取過夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株豬種布魯菌S2的細(xì)菌DNA，調(diào)整模板DNA水平為120 ng/μL，用無菌蒸餾水進(jìn)行1∶10、1∶102、1∶103連續(xù)倍比稀釋直到1∶109，分別取稀釋后的DNA 2 μL作為反應(yīng)模板，用于RealAmp反應(yīng)，驗(yàn)證方法的靈敏度。

1.3.6臨床應(yīng)用 提取培養(yǎng)的布魯菌臨床分離株的DNA，用RealAmp進(jìn)行檢測(cè)。抽取疑似布魯菌病患者外周血2～3 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，患者同時(shí)抽取5～10 mL外周血做血培養(yǎng)。按照人血液基因組提取試劑盒的要求提取人全血基因組DNA，用已建立的RealAmp方法進(jìn)行患者外周血微量布魯菌DNA檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1最佳引物的篩選 當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至10 min左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)管的熒光強(qiáng)度大幅度增加，直至反應(yīng)結(jié)束，儀器判定為陽性結(jié)果。陰性對(duì)照管熒光曲線一直處于平滑的狀態(tài)，直到反應(yīng)終止也沒有發(fā)生大幅度的曲線斜率的變化，儀器判定為陰性結(jié)果，說明沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光曲線表明，所有實(shí)驗(yàn)管都在10 min左右擴(kuò)增出目的基因。比較4套引物的擴(kuò)增效率，選擇擴(kuò)增效率最高的第2套引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2特異性實(shí)驗(yàn) 以非布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，本實(shí)驗(yàn)均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，只有豬種布魯菌S2的DNA發(fā)生特異性擴(kuò)增并被檢測(cè)出來。說明本研究的RealAmp方法對(duì)布魯菌檢測(cè)的特異性好，與非目標(biāo)菌不存在擴(kuò)增反應(yīng)。

2.3靈敏度實(shí)驗(yàn) 布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 1∶10～1∶107各水平檢測(cè)結(jié)果均為陽性，而1∶108、1∶109為陰性。RealAmp檢測(cè)布魯菌的靈敏度為1.2×10-5ng/μL。

2.4臨床應(yīng)用 用RealAmp方法檢測(cè)16株布魯菌臨床分離株的DNA后，擴(kuò)增結(jié)果均呈陽性，表明該方法可用于布魯菌DNA的檢測(cè)。抽取28例疑似布魯菌病患者外周血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，患者同時(shí)抽取5～10 mL外周血做血培養(yǎng)。提取EDTA-K2抗凝血中的血液基因組DNA，用已建立的RealAmp方法進(jìn)行患者外周血微量布魯菌DNA檢測(cè)。其中12份標(biāo)本RealAmp檢測(cè)為陽性結(jié)果，陽性率為42.9%；28份標(biāo)本血培養(yǎng)結(jié)果顯示，11份標(biāo)本為血培養(yǎng)陽性，陽性率為39.3%。新建的RealAmp方法與血培養(yǎng)的符合率為96.4%(27/28)。

3 討 論

布魯菌病是由布魯菌引起的一種傳染變態(tài)反應(yīng)性疾病，家畜和野生動(dòng)物被認(rèn)為是傳染源[4]。因?yàn)椴剪斁∈且环N全身性感染，可以影響任何器官或系統(tǒng)。布魯菌病具有獨(dú)特的流行病學(xué)和致病特征，其中一個(gè)獨(dú)有的特征是菌血癥在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用非常重要[5]。布魯菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是從血液或骨髓等培養(yǎng)物中分離出布魯菌[6]。目前布魯菌血癥的實(shí)驗(yàn)室診斷依賴于血培養(yǎng)，因此建立快速檢驗(yàn)布魯菌血癥的RealAmp方法，對(duì)布魯菌血癥的診斷和治療具有重要的意義。

LAMP通過設(shè)計(jì)的引物和置換DNA擴(kuò)增技術(shù)，在30～60 min的恒溫條件下(通常為60～65 ℃)，利用高活性鏈置換Bst DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，產(chǎn)生大量莖環(huán)狀擴(kuò)增產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的快速檢測(cè)。LAMP自開發(fā)以來，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢測(cè)[7-9]。LAMP方法不僅對(duì)核酸提取要求低，而且靈敏度高，可從極微量的標(biāo)本中擴(kuò)增出目的基因，其靈敏度是傳統(tǒng)PCR的10～100倍[10]。LAMP反應(yīng)最重要的優(yōu)點(diǎn)是可以在恒定溫度下進(jìn)行，不需要依賴特殊設(shè)備[11]。LAMP產(chǎn)物檢測(cè)最初應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳，后來開發(fā)了基于反應(yīng)過程中的副產(chǎn)物(白色焦磷酸鎂沉淀)濁度的肉眼或濁度儀檢測(cè)來判定擴(kuò)增與否。最近，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)提高了擴(kuò)增信號(hào)的可靠性[12]。

本研究建立的針對(duì)布魯菌OMP25基因的RealAmp方法只針對(duì)布魯菌擴(kuò)增，對(duì)其他干擾菌不擴(kuò)增，顯示出良好的特異性。本實(shí)驗(yàn)選用的恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Fluo-Gene及配套的RealAmp試劑盒，操作簡便、結(jié)果可視化，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在30 min內(nèi)即可完成。恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Fluo-Gene的應(yīng)用，不僅使操作者遠(yuǎn)離了溴化乙錠、紫外燈等對(duì)身體的危害，而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原菌從始到終全封閉式檢測(cè)。目前，市場(chǎng)上常見的LAMP平臺(tái)主要有 Eiken公司生產(chǎn)的LA-200，Lumora公司生產(chǎn)的BART和 Optigene公司生產(chǎn)的GenieⅡ[13]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的檢測(cè)平臺(tái)Fluo-Gene所需要的時(shí)間最短，整個(gè)擴(kuò)增過程僅需20 min。

本研究建立了特異、靈敏和可靠的RealAmp方法用于布魯菌DNA檢測(cè)。該方法能夠從布魯菌血癥患者外周血提取的DNA樣品中擴(kuò)增出微量的布魯菌DNA，靈敏度可達(dá)1.2×10-5ng/μL。來自疑似布魯菌病患者的28份臨床標(biāo)本，雖然RealAmp檢測(cè)陽性率與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)(39.3%)陽性率基本持平，但是RealAmp僅需要外周血2～3 mL，且當(dāng)天即可得出結(jié)果，而血培養(yǎng)時(shí)間至少需要5 d，甚至20多天。與血培養(yǎng)相比，RealAmp簡便、快捷，可以方便地實(shí)現(xiàn)布魯菌血癥的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

綜上所述，本研究針對(duì)布魯菌OMP25基因建立的RealAmp方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便高效等特點(diǎn)，為布魯菌的快速檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，具有良好的發(fā)展前景。