現(xiàn)代微生物分類鑒定技術(shù)在綠色環(huán)?；拙漆勗熘械膽?yīng)用

隋 明,謝慧蓉,周 文,唐賢華

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 酒類與食品工程系,四川 都江堰 611830;2.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院,四川 成都 610065)

白酒是經(jīng)過不同種屬微生物長時(shí)間發(fā)酵、陳釀分離形成的澄清透明的含乙醇產(chǎn)品。隨著科學(xué)和現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展,微生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于白酒釀造。社會(huì)的不斷發(fā)展和人類健康意識(shí)的不斷增強(qiáng),要求白酒釀造業(yè)實(shí)現(xiàn)綠色環(huán)保化,即生態(tài)釀酒,以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益的有效統(tǒng)一。這要求釀酒業(yè)應(yīng)用現(xiàn)代微生物分類鑒定技術(shù),尤其是對(duì)以PCR[1]和DNA[2]為主的微生物進(jìn)行分類鑒定的技術(shù),以確定白酒釀造不同階段的優(yōu)勢(shì)菌群。

1 白酒的微生物分類鑒定技術(shù)概述

白酒作為一種常見且傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品,對(duì)發(fā)酵窖池的要求較高。白酒發(fā)酵時(shí)窖池中的微生物及其形成情況對(duì)酒體風(fēng)格有重要影響[3]。五糧液、瀘州老窖等大型白酒企業(yè)都在窖池中培養(yǎng)微生物生存環(huán)境,以便微生物在窖池中發(fā)酵形成新的能量[4]?，F(xiàn)代生物工程技術(shù)的研發(fā)為微生物的分類鑒定帶來了發(fā)展空間。在傳統(tǒng)微生物分類鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)上[5],借鑒微生物代謝組學(xué)[6]和PCR、DGGE等微生物分析技術(shù)[7],可以為釀酒產(chǎn)業(yè)創(chuàng)建更好、更具體、更深刻的現(xiàn)代微生物分類鑒定技術(shù),以彌補(bǔ)傳統(tǒng)微生物分類鑒定技術(shù)的不足?，F(xiàn)代微生物分類鑒定技術(shù)能在釀酒發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)微生物技術(shù)與其代謝規(guī)律的有效結(jié)合。

2 微生物分類鑒定技術(shù)在綠色環(huán)保化白酒釀造中的應(yīng)用

綠色環(huán)?；拙漆勗旒瓷鷳B(tài)釀酒由沱牌集團(tuán)的工程師提出。生態(tài)釀酒主要是指建立科學(xué)合理的微生物培養(yǎng)環(huán)境,用安全、高質(zhì)量的方式實(shí)現(xiàn)釀酒行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的最大化;在整個(gè)白酒釀造過程中實(shí)現(xiàn)人與自然的和諧相處；對(duì)現(xiàn)有的釀酒資源給予低能耗處理,將綠色發(fā)展理念融入每一個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié),讓微生物的繁殖和生長建立在可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)之上。

2.1 傳統(tǒng)微生物分類鑒定技術(shù)

在新技術(shù)產(chǎn)生之前,白酒釀造過程中微生物的分類鑒定一般采取直接的方式,主要分為五個(gè)步驟。第一步是微生物樣品采集,包括酒曲、酒醪和制作過程中接觸的空氣微生物和水。第二步是對(duì)采集到的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù),方法有三種[8]:一是通過顯微鏡觀察,這種方法要求先對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,且只能記錄微生物菌落的數(shù)量,無法對(duì)微生物的性質(zhì)做出區(qū)分;二是活菌計(jì)數(shù)法,這種方法能顯示活菌的數(shù)量,但無法對(duì)死菌或休眠的菌體進(jìn)行計(jì)算；三是最大可能計(jì)數(shù)法,通常用于測(cè)定具有特殊功能的菌群。第三步是釀酒微生物的培養(yǎng)和繁殖,目的是擴(kuò)大活菌數(shù)量,增加釀酒過程中的菌落。第四步是微生物分離,采用的是梯度稀釋法,即對(duì)采集的微生物進(jìn)行平板畫線,有效分離菌落。第五步是微生物鑒定,需要生化實(shí)驗(yàn)輔助完成,即按相關(guān)說明和規(guī)范,對(duì)采集分離的微生物進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn),并檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定微生物菌株。

2.2 基于PCR 的DNA指紋圖譜分類鑒定技術(shù)

近年來生物分類鑒定技術(shù)得到良好發(fā)展,PCR技術(shù)在釀酒業(yè)中被廣泛應(yīng)用。用這種方式對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定,不但快速、便捷、能耗低,而且可以驗(yàn)證原料是否是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[9]。使用數(shù)學(xué)模型如聚類分析法等對(duì)用氣質(zhì)聯(lián)用、液相色譜測(cè)定的白酒風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類,能得到白酒樣品的風(fēng)味特征,這種方法被稱為指紋圖譜法。展學(xué)孔等采用指紋圖譜法測(cè)定小曲白酒的風(fēng)味強(qiáng)度特征等,發(fā)現(xiàn)原料的品種和產(chǎn)地對(duì)白酒品質(zhì)有較大影響[10]。

2.2.1 PCR-DGGE 克隆分析技術(shù)

PCR-DGGE 克隆分析技術(shù)也叫變性梯度凝膠電泳技術(shù),是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的后續(xù)變形方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的具體應(yīng)用是對(duì)微生物體內(nèi)存在特異性目的的片段進(jìn)行擴(kuò)張,使其改變?cè)械男螒B(tài)。使用變性梯度凝膠電泳技術(shù)，在聚丙烯酰胺凝膠中添加尿素和變性劑,同時(shí)控制凝膠比例,能使微生物的DNA排列發(fā)生梯度變化。在外部電壓相同的條件下,DNA的解鏈速度會(huì)發(fā)生改變,相應(yīng)的電泳遷移率也會(huì)變化,可以從電泳上分離出需要的DNA片段,并用PCR-DGGE 克隆分析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行處理,以完成對(duì)微生物的分類鑒定。目前有學(xué)者將該項(xiàng)技術(shù)用于白酒釀造,如胡曉龍使用該項(xiàng)技術(shù)考察了濃香型白酒窖泥中梭菌的群落結(jié)構(gòu)與窖泥質(zhì)量之間的關(guān)系[11];江汶鈺等使用PCR-DGGE技術(shù)研究了豉香型白酒中的細(xì)菌群落[12]。

2.2.2 SSCP 技術(shù)

SSCP技術(shù)[13]建立在DNA特性基礎(chǔ)上,結(jié)合PCR-DGGE 克隆分析技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。這種方法更需要注意細(xì)節(jié)控制,主要目的是分析微生物的遺傳學(xué)特征。微生物菌落中有不同的基因序列,且序列長而完整,能夠提供豐富的分類信息。SSCP技術(shù)在釀酒過程中經(jīng)常被用于鑒定霉菌分子微生物。

2.2.3 末端限制性片段長度分析技術(shù)

末端限制性片段長度分析技術(shù)是專門用于鑒定不同微生物群落的方法,也是一種指紋技術(shù)。微生物群落呈現(xiàn)的多樣性能被敏銳地檢測(cè)。將微生物設(shè)計(jì)成一對(duì)合適的引物,并做好明顯標(biāo)記,經(jīng)過PCR克隆擴(kuò)展,加上酶切后特定的生長順序,將檢測(cè)到的標(biāo)記與DNA片段進(jìn)行對(duì)比,了解微生物群落的差異性,鑒定微生物群落的屬性。

2.2.4 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)需要末端限制性片段長度分析技術(shù)做載體,并從中選擇聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),將可以利用的酶作為研究對(duì)象進(jìn)行基因順序的排列組合,培養(yǎng)不同的酶切片段。培養(yǎng)出的酶切片段可以用來和有共同黏性末段的人工接頭連接,形成技術(shù)模板,在其中加入引物,用克隆分析技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)展,只有配對(duì)的微生物酶切片段才能被擴(kuò)展。

2.3 磷脂脂肪酸法

磷脂脂肪酸法是從20世紀(jì)開始用于白酒研究的,用于幫助確定微生物定量問題，具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)。不同種類的微生物菌類群落可以用不同的磷脂脂肪酸法進(jìn)行研究?？梢越柚鷪D譜對(duì)微生物進(jìn)行定量研究,標(biāo)記設(shè)置的微生物群,確定群中微生物的性質(zhì)和數(shù)量。磷脂脂肪酸法還可以用于鑒別活體的微生物群落。通常,我們認(rèn)為微生物體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量是一定的,在對(duì)微生物的種類進(jìn)行鑒別時(shí),這種方法具有輔助作用。曹宇等使用磷脂脂肪酸法研究了芝麻香型大曲中微生物群落的真菌、細(xì)菌含量及數(shù)量上的變化情況[14]。

2.4 Biolog微平板

Biolog 微平板是美國在20 世紀(jì)研發(fā)的一種技術(shù),最初只能用于對(duì)純種的微生物進(jìn)行分類鑒定,經(jīng)過發(fā)展,現(xiàn)已能鑒定兩千多種菌類。Biolog 微平板能準(zhǔn)確估計(jì)釀酒時(shí)微生物的生物群落代謝問題，具有靈活、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。Biolog 微平板具有自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗(yàn)方式,能提升微生物分類鑒定效率。唐小麗等利用該技術(shù)分析芝麻香型白酒高溫大曲的微生物群落,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中的曲樣可以根據(jù)發(fā)酵時(shí)間分為四類[15]。

2.5 RNA/rDNA 序列分析

16SrRNA/rDNA 序列分析是現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)的微生物鑒定方法,是通過對(duì)微生物的鑒定、擴(kuò)展、測(cè)序相關(guān)記錄進(jìn)行分析,按照國際標(biāo)準(zhǔn)將測(cè)序結(jié)果分成多個(gè)組合單元,最后將合成的數(shù)據(jù)提交到數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,查詢相似度最高的序列,并設(shè)置發(fā)育樹,對(duì)微生物進(jìn)行良好定位,便于查詢對(duì)比。18SrRNA/rDNA 序列分析主要用于奠定微生物群落在系統(tǒng)中的發(fā)育地位,因?yàn)闊o論是16SrDNA還是18SrDNA,都不會(huì)輕易受環(huán)境影響而改變自己的性質(zhì),因此，通過比較兩者的同源性可以確定它們?cè)诎l(fā)育過程中的不同。

3 結(jié)語

白酒的釀造離不開微生物的作用。使用不同微生物分類鑒定技術(shù)既能發(fā)現(xiàn)微生物在釀造不同香型、不同窖齡白酒中的作用,也可以減少白酒釀造和檢測(cè)過程中的環(huán)境污染和原料浪費(fèi),更好地實(shí)現(xiàn)白酒綠色低碳產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。在發(fā)展生態(tài)釀酒的過程中,可以通過微生物技術(shù)了解不同微生物的層次、性質(zhì)和數(shù)量,掌握微生物的發(fā)展規(guī)律,尤其是曲子、窖泥中微生物群落演替的變化規(guī)律,為白酒口味的釀造奠定良好的基礎(chǔ)。