非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測中的常見問題

潘慧芳

（清遠(yuǎn)市動物疫病預(yù)防控制中心 511500）

非洲豬瘟 （African swine fever，ASF） 是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。 該病病程短，死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫病。ASFV 可感染家豬、野豬和軟蜱，是唯一一種節(jié)肢動物作為傳播媒介的DNA 病毒。 家豬感染后的臨床表現(xiàn)和病理變化以及流行病學(xué)特點類似于急性豬瘟，但更為急劇，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，致死率高達(dá)100%[1]。2018 年8 月，遼寧省沈陽市確診我國首例非洲豬瘟，至今全國所有省份都已出現(xiàn)非洲豬瘟疫情[2],對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前， 各級獸醫(yī)實驗室主要采用熒光定量PCR 開展ASFV檢測工作。 但在日常工作中，常常出現(xiàn)假陽性、陽性對照或陽性樣品不顯示Ct 值和檢測樣品無典型“S”形擴(kuò)增曲線但其Ct 值顯示為陽性等問題。 筆者通過查閱大量文獻(xiàn)以及結(jié)合平時的工作經(jīng)驗，分析了上述問題的可能原因和解決方案。

1 熒光定量PCR 檢測假陽性的原因與預(yù)防措施

據(jù)文獻(xiàn)報道[3]，出現(xiàn)假陽性的主要原因有實驗室檢測功能區(qū)域設(shè)置不合理、檢測人員、物品流向不合理、實驗人員在核酸提取與試劑配制時未在獨立的生物安全柜中進(jìn)行、 實驗人員操作不規(guī)范以及實驗結(jié)束后清潔消毒不徹底等。 針對上述問題，應(yīng)從實驗室布局、檢測人員自身和實驗室生物安全方面進(jìn)行改進(jìn)。

1.1 完善實驗室功能分區(qū)

從事分子生物學(xué)檢測活動，微量的核酸污染即可嚴(yán)重影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。 在設(shè)計分子生物學(xué)實驗室時，必須按照分子生物學(xué)試驗的具體要求，將實驗室嚴(yán)格分隔成試劑配制區(qū)、核酸提取區(qū)、 核酸擴(kuò)增區(qū)、PCR 產(chǎn)物分析區(qū)等完全獨立的功能室，做到對互不相容活動的相鄰試驗區(qū)域形成真正有效的隔離， 防止交叉污染的發(fā)生[3]。

1.2 檢測人員正確規(guī)范操作

從事熒光定量PCR 試驗的檢測人員，必須經(jīng)培訓(xùn)合格后上崗，切實掌握PCR 檢測操作原理、方法和步驟，嚴(yán)格按照實驗室建立的檢測操作規(guī)程和試劑盒操作說明書進(jìn)行各項實驗活動。所有ASFV 檢測的操作步驟必須在生物安全柜或者負(fù)壓實驗室進(jìn)行處理，處理完畢之后，對操作臺面和房間進(jìn)行徹底消毒。 試驗人員進(jìn)入各個操作區(qū)域后，要嚴(yán)格單向移動，即試劑配制區(qū)→樣品提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。

PCR 擴(kuò)增完成后， 盡量避免打開密封反應(yīng)體系。 禁止把PCR 產(chǎn)物帶到配制PCR 體系的區(qū)域內(nèi)， 同時禁止在配制PCR反應(yīng)體系的區(qū)域內(nèi)，操作含核酸或質(zhì)粒的溶液[3]。

1.3 做好實驗室生物安全

熒光PCR 試驗完畢后，必須對實驗室環(huán)境徹底消毒。 生物安全柜和潔凈工作臺進(jìn)行紫外照射消毒， 時間不低于30min，以破壞殘留的核酸； 工作臺面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；實驗室內(nèi)的樣本液和擴(kuò)增產(chǎn)物是氣溶膠的主要污染源，故實驗室要經(jīng)常換氣和消毒；所有試驗區(qū)域，包括懸掛白大褂位置、放置高速離心機(jī)位置、放置PCR 儀等區(qū)域都要用可移動紫外線燈照射30min[2]。

2 熒光定量PCR 的Ct 值和熒光擴(kuò)增曲線異常

在熒光定量PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計， 熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。 每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化， 從而得到熒光擴(kuò)增曲線。 把PCR 反應(yīng)的前6 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號， 熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是2～6 個循環(huán)本底熒光信號平均值的12 倍。 樣品的熒光強(qiáng)度超過背景熒光值（熒光閾值）的時刻所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，叫做Ct 值。

2.1 陽性對照或陽性樣品不顯示Ct 值及解決方案

日常檢測非洲豬瘟樣品時，常常出現(xiàn)陽性對照有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，但不顯示Ct 值（Ct 值顯示為Undetermined）。 有學(xué)者指出[4]，出現(xiàn)這種情況的主要原因是儀器默認(rèn)的熒光閾值線過高。 解決方案：將熒光閾值一般設(shè)在PCR 指數(shù)擴(kuò)增的起始，并高于陰性對照曲線。 其數(shù)值選擇與試劑盒的性能有關(guān)，對熒光強(qiáng)度較高的擴(kuò)增曲線， 閾值的設(shè)定不一定非要遵循固定的原則。 因此，針對試劑盒性能不同，實驗室應(yīng)建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測結(jié)果的穩(wěn)定性[4]。

2.2 檢測樣品無典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其Ct 值顯示為陽性及解決方案

實際檢測過程中，也會遇到被檢樣品無典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其Ct 值顯示為陽性（按照試劑盒說明書Ct 值判定標(biāo)準(zhǔn)）的情況。其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)， 主要是被檢樣品不夠新鮮或經(jīng)反復(fù)凍融等導(dǎo)致的。 因此，被檢樣品要盡量新鮮，4℃～8℃保存的血清或抗凝血樣品一般不超過120 h，唾液樣品、組織樣品凍融次數(shù)一般不超過3 次[4]。