同型半胱氨酸影響Caco-2細(xì)胞通透性的機制研究

姚成云，丁少楨，楊 青，劉曉昌，徐張巍，梅 俏，許建明

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種發(fā)病機制尚不明確的腸道炎癥性疾病[1]，腸黏膜屏障通透性改變在IBD的發(fā)生與發(fā)展中有重要作用。緊密連接(tight junction，TJ)是腸黏膜上皮機械屏障中的重要結(jié)構(gòu)[2]，TJ損傷引起的腸上皮通透性增加，參與了IBD病理生理過程?？缒さ鞍?包括Claudin及Occludin)和外周蛋白是TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，受肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)調(diào)控，引起TJ通透性改變，參與腸黏膜通透性的調(diào)節(jié)[3]。

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一種含硫氨基酸,可通過多種機制參與血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷過程。IBD患者血漿及結(jié)腸中Hcy水平升高，且Hcy能夠損傷腸上皮細(xì)胞線粒體功能[4]，但Hcy是否通過調(diào)控MLCK蛋白影響腸上皮TJ通透性目前尚不明確。該研究在建立Caco-2模型基礎(chǔ)上，研究Hcy是否參與調(diào)控MLCK蛋白表達(dá)影響腸黏膜通透性及其機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

1.1.1實驗細(xì)胞 Caco-2細(xì)胞，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.1.2藥品與試劑 同型半胱氨酸、異硫氰酸熒光素、ML-7、SB203580、DEME高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸、胰蛋白酶均購于美國Sigma-Aldrich公司；MLCK、MEK、ERK、p-ERK、Claudin-1、Claudin-2購于南京Bioworld公司；Occludin購于美國Proteintech公司；p-MLCK購于美國Santa Cruz公司；KN62、PD98059、Staurosporine、Y27632購于美國Selleck公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；L-谷氨酰胺購于美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素混合溶液購于上海篤瑪生物科技公司。

1.1.3主要儀器 F2700型熒光分光光度計，購于日本島津公司；Transwell小室(型號3413)，購于美國Corning公司；Millicel@-ERS細(xì)胞電阻儀，購于德國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1Caco-2細(xì)胞通透性模型的建立及分組 Caco-2細(xì)胞通透性模型的建立：Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣濕度，培養(yǎng)基使用含15%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。每2～3天進行換液，當(dāng)細(xì)胞生長至80%連續(xù)時，使用含0.05% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，以5×105個/孔的密度接種于12孔Transwell incerts(孔徑0.4 μm)的上槽中。接種后，每2天換液，1周后改為每天換液，直至21 d。Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞分為空白對照組、Hcy處理組(10、20、50 μmol/L)、Hcy+信號通路抑制劑處理組(ERK抑制劑PD98059、MLCK抑制劑ML-7、P38MAPK抑制劑SB203580、Ca2+/Calmodulin抑制劑KN62、Rho抑制劑Y27632及PKC抑制劑Staurosporine)。

1.2.2Caco-2細(xì)胞通透性檢測 Caco-2細(xì)胞模型的通透性通過檢測跨上皮電流阻抗(transepithelial electrical resistance，TEER)及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)跨膜轉(zhuǎn)運量改變來評估。棄去12孔板中培養(yǎng)基，加入含不同濃度Hcy(10、20、50 μmol/L)的PBS液孵育后，通過對TEER及FITC轉(zhuǎn)運進行檢測來確定Hcy的最優(yōu)濃度。TEER采用Millicell ERS細(xì)胞電阻儀測量，實驗開始后每30分鐘檢測TEER并記錄，同時于下槽取樣并保存于4 ℃冰箱中，直至第180分鐘實驗結(jié)束。收集的樣品經(jīng)稀釋、離心后使用熒光分光光度計檢測樣品上清液中FITC熒光值(設(shè)置激發(fā)波長為380 nm,吸收波長為425 nm)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出樣品中FITC濃度，即FITC跨膜轉(zhuǎn)運量，借此評估Caco-2細(xì)胞模型的通透性。實驗結(jié)束后將Caco-2細(xì)胞用胰酶消化并收集細(xì)胞懸液，保存于液氮中用于Western blot檢測。

1.2.3Western blot法檢測Caco-2細(xì)胞中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK、ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin蛋白表達(dá)水平 從Caco-2細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，使用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫下用封閉液(5%脫脂乳)封閉2 h。將膜與一抗在4 ℃溫育過夜。一抗包括抗MEK(1 ∶500)、ERK(1 ∶1 000)、p-ERK(1 ∶2 000)、MLCK(1 ∶500)、p-MLCK(1 ∶200)、ZO-1(1 ∶500)、Claudin-1(1 ∶500)、Claudin-2(1 ∶500)、Occludin(1 ∶600)和beta-actin(1 ∶1 000)。TBST洗滌，將HRP連接的二抗在室溫下與膜溫育2 h。再次洗滌，使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)和Image J軟件檢測分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理計數(shù)資料采用SPSS 16.0軟件分析，兩兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對Caco-2細(xì)胞通透性的影響使用不同濃度Hcy(0、10、20、50 μmol/L)處理Caco-2細(xì)胞，記錄TEER和FITC跨膜轉(zhuǎn)運量隨時間的改變，結(jié)果顯示，隨Hcy濃度的增加Caco-2細(xì)胞TEER逐漸降低，F(xiàn)ITC跨膜轉(zhuǎn)運量逐漸增加。當(dāng)使用50 μmol/L Hcy處理Caco-2細(xì)胞時，TEER(圖1A)及FITC跨膜轉(zhuǎn)運量(圖1B)改變速率最快。表明Hcy能夠增加Caco-2細(xì)胞的通透性且具有濃度依賴性，后續(xù)采用50 μmol/L Hcy進行作用機制研究。

圖1 不同濃度Hcy對Caco-2細(xì)胞TEER和FITC跨膜轉(zhuǎn)運量的影響

A：Caco-2細(xì)胞TEER隨Hcy濃度的變化；B：Caco-2細(xì)胞FITC跨膜轉(zhuǎn)運量隨Hcy濃度的變化

2.2 MLCK抑制劑ML-7對Hcy增加Caco-2細(xì)胞通透性的影響與Hcy處理組比較，Hcy+ML-7處理組Caco-2細(xì)胞TEER增加(圖2A)，F(xiàn)ITC跨膜轉(zhuǎn)運量顯著減少[(31.23±9.01) μg/mlvs(43.05±14) μg/ml,t=2.459,P<0.05](圖2B)，提示MLCK抑制劑具有抑制Hcy引起Caco-2細(xì)胞通透性增加的作用，MLCK可能在Hcy增加Caco-2細(xì)胞通透性過程中發(fā)揮作用。

2.3 PD98059、SB203580、KN62、Y27632和staurosporine對Hcy增加Caco-2細(xì)胞通透性的影響與Hcy組比較，Hcy+PD98059處理組Caco-2細(xì)胞TEER增加，F(xiàn)ITC跨膜轉(zhuǎn)運量顯著減少[(30.83±5.96) μg/mlvs(41.9±8.29) μg/ml,t=3.756,P<0.05；而SB203580、KN62、Y27632、staurosporine對Hcy處理后Caco-2細(xì)胞的TEER和FITC跨膜轉(zhuǎn)運量無顯著影響，提示ERK-MLCK信號通路在Hcy增加Caco-2細(xì)胞通透性過程中發(fā)揮作用(圖3)。

圖2 ML-7抑制Hcy引起的Caco-2細(xì)胞通透性增加

A：ML-7增加Hcy 處理后Caco-2細(xì)胞的TEER；B:ML-7降低Hcy處理后Caco-2細(xì)胞的FITC跨膜轉(zhuǎn)運量；與Hcy組比較：*P<0.05

2.4 Hcy對Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，50 μmol/L Hcy處理的Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)減少，Claudin-2蛋白表達(dá)增加(圖4)。

2.5 ML-7和PD98059對Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響與Hcy組比較，Hcy+ML-7處理組(圖5A)和Hcy+PD98059處理組(圖5B)Caco-2細(xì)胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)均增加，Claudin-2蛋白表達(dá)均減少，提示抑制ERK-MLCK信號通路可能是Hcy調(diào)控Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.6 MEK-ERK-MLCK信號通路在Hcy增加Caco-2細(xì)胞通透性中的作用Western blot檢測結(jié)果顯示，50 μmol/L Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中MEK、MLCK、p-MLCK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加。而再分別使用ML-7(圖6A)和PD98059(圖6B)處理后Caco-2細(xì)胞中MEK、MLCK、p-MLCK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)均下降。提示Hcy可能通過MEK-ERK-MLCK信號通路抑制細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)，促進細(xì)胞通透性增加。

圖3 不同信號通路抑制劑對Caco-2細(xì)胞TEER和FITC跨膜轉(zhuǎn)運量的影響

A：Caco-2細(xì)胞TEER隨Hcy濃度的變化；B:Caco-2細(xì)胞FITC跨膜轉(zhuǎn)運量隨Hcy濃度的變化；1.Hcy組;2.Hcy+PD98059組;3.Hcy+SB203580組;4.Hcy+Y27632組;5.Hcy+KN62組;6.Hcy+staurosporine組；與Hcy組比較：*P<0.05

圖4 Hcy對Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響

圖5 ML-7和PD98059對Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中細(xì)胞連接蛋白表達(dá)的影響

A：ML-7促進Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)，抑制Claudin-2的表達(dá)；B：PD98059促進Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin的表達(dá)，抑制Claudin-2的表達(dá)

圖6 ML-7 和PD98059對Hcy處理后MEK-ERK-MLCK信號通路蛋白表達(dá)的影響

A：ML-7抑制Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中MEK-ERK-MLCK信號通路蛋白的表達(dá)；B：PD98059抑制Hcy處理后Caco-2細(xì)胞中MEK-ERK-MLCK信號通路蛋白的表達(dá)

3 討論

IBD是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機制目前尚不完全清楚，腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常引起的炎癥在IBD發(fā)病過程中起著重要作用。同型半胱氨酸是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物。Hcy通過刺激MMP合成，促進炎癥因子表達(dá)如TNF-α，IL-6和IFN-γ，激活NADPH和p38MAPK，調(diào)控心血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。同時發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸組織及血漿中Hcy水平較健康對照相比明顯升高[5]，血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障與腸黏膜上皮屏障存在結(jié)構(gòu)上的相似性，Hcy是否通過對腸道黏膜屏障通透性產(chǎn)生影響，參與IBD發(fā)病機制目前相關(guān)研究較少。

Caco-2細(xì)胞與人的腸道黏膜上皮細(xì)胞屏障在形態(tài)、極性以及轉(zhuǎn)運體的表達(dá)上相似，被廣泛用于研究腸道黏膜屏障功能調(diào)節(jié)的相關(guān)機制[6]。TJ是腸道黏膜屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是頂端連接復(fù)合體的重要組成部分，控制細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)腸上皮的通透性。Claudin-1在上皮細(xì)胞周圍形成連續(xù)的封閉結(jié)構(gòu)，起到固定TJ結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用。細(xì)胞中Claudin-1的過度表達(dá)有助于增加TEER[7]，Claudin-2參與形成跨膜通道運輸水和小分子物質(zhì)以及上皮細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)[8]。Claudin-2基因敲除可使MDCK細(xì)胞TEER增加[9]。Occludin敲除小鼠的細(xì)胞旁通透性與野生型相比沒有明顯增加[10]。ZO-1連接跨膜蛋白與細(xì)胞骨架，細(xì)胞骨架對形成TJ結(jié)構(gòu)起著重要作用[11]，敲除ZO-1會引起TJ結(jié)構(gòu)與功能的破壞[12]。本研究中，對Hcy處理Caco-2細(xì)胞的檢測表明，Hcy可降低Caco-2細(xì)胞中ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表達(dá)，增加Claudin-2表達(dá)，提示Hcy可通過影響Caco-2細(xì)胞TJ蛋白影響Caco-2細(xì)胞通透性。

MLCK介導(dǎo)肌球蛋白輕鏈磷酸化通路是調(diào)控TJ結(jié)構(gòu)及功能的重要信號通路。磷酸化的肌球蛋白輕鏈發(fā)生構(gòu)象改變，引起肌動蛋白與肌球蛋白絲收縮，引起上皮細(xì)胞TJ開放，參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞黏膜通透性的調(diào)節(jié)過程。 MLCK表達(dá)增加可以上調(diào)MLC磷酸化水平，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮加劇，通透性增加，細(xì)胞形態(tài)和功能完整性遭到破壞[13]。Hcy作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以促進其MLCK的表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示Hcy增加Caco-2細(xì)胞中MLCK、p-MLCK的蛋白表達(dá)，使用ML-7抑制劑預(yù)處理Caco-2細(xì)胞可明顯改善Hcy引起的TEER降低，提示Hcy可以影響Caco-2細(xì)胞中MLCK磷酸化過程，調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞通透性改變。

MLCK受P38MAPK、Rho激酶、ERK、鈣調(diào)素依賴激酶、PKC等多種信號通路調(diào)控。研究[15]表明，MEK/ERK/MAPK信號通路參與MLCK功能調(diào)控，MEK可激活ERK促進ERK磷酸化，最后激活MLCK。本研究通過使用不同工具藥(ERK抑制劑PD98059，P38MAPK抑制劑SB203580，Rho激酶抑制劑Y27632，鈣調(diào)素依賴激酶抑制劑KN62，PKC抑制劑Staurosporine，MLCK抑制劑ML-7)干預(yù)Hcy處理的Caco-2細(xì)胞，結(jié)果提示Hcy主要通過MEK-ERK蛋白調(diào)節(jié)MLCK磷酸化，參與調(diào)節(jié)TJ功能。

本研究結(jié)果顯示Hcy增加Caco-2細(xì)胞中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK的蛋白表達(dá)，使用PD98059及ML-7抑制劑預(yù)處理Caco-2細(xì)胞可明顯改善Hcy引起的TEER降低，下調(diào)MLCK、Claudin-2蛋白表達(dá)，ZO-1、Claudin-1及Occludin表達(dá)有較大程度回升，提示Hcy可能通過促進MEK-ERK-MLCK蛋白磷酸化過程，影響TJ結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，損傷腸上皮細(xì)胞TJ，引起腸黏膜通透性增加，加重腸道炎癥過程，為闡明IBD中Hcy影響腸黏膜通透性的作用機制提供實驗依據(jù)。