胰島素、格列本脲、二甲雙胍改善GDM鼠脂代謝

汪 洋，陳可洋

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitu, GDM)是指妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度葡萄糖耐量降低或異常，已經(jīng)成為妊娠期普遍的并發(fā)癥[1]。GDM是糖尿病的一種特殊類型，全球發(fā)病率為1%～14%，國內(nèi)GDM發(fā)生率為6.8%～10.4%，并呈逐年上升趨勢[2]。胰島素、格列本脲和二甲雙胍對GDM的應(yīng)用在國外較為廣泛，而國內(nèi)格列本脲和二甲雙胍對GDM的臨床治療尚未得到推廣。該研究擬探討胰島素、格列本脲和二甲雙胍對GDM小鼠脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6J小鼠(8周齡，雄性小鼠體質(zhì)量：20～24 g；雌性小鼠體質(zhì)量：17～20 g)購自南京大學(xué)模型動物研究中心。試驗前動物自由進食標(biāo)準(zhǔn)飼料，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。實驗室溫度：20～25 ℃，濕度：(50±5)%。適應(yīng)1周后，合籠。查陰栓確認(rèn)交配，記為妊娠日(GD0)。

隨機選取8只孕鼠作為正常對照組(N組)。剩下的孕鼠在GD6、GD7和GD8分別以40 mg/kg每只單次注射鏈脲佐菌素，空腹血糖濃度超過11.1 mmol/L[3]確立為GDM鼠。GDM鼠32只，隨機分為4組(8只/組)：GDM對照組(G組)、胰島素干預(yù)組(GI組)、格列本脲干預(yù)組(GG組)和二甲雙胍干預(yù)組(GM組)。

GI組由最初皮下注射7～10 U/kg，從GD11至GD18用胰島素注射液(人生物合成長效胰島素，Novo Nordisk A/S，丹麥)干預(yù)。GG組以每只小鼠從GD 11至GD 18用格列本脲片劑20 mg/kg/d(批號：2716065，天津太平洋制藥有限公司)研磨成粉，溶于生理鹽水灌胃。GM組以每只小鼠從GD11到GD18用鹽酸二甲雙胍腸溶片300 mg/kg/d(批號：20160117，貴州圣濟堂制藥有限公司)研磨成粉，溶于生理鹽水灌胃。

1.2 生化指標(biāo)檢測以及蛋白質(zhì)印跡試驗每組8只孕鼠在GD18剖殺，收集血液，肝組織。全血凝固后在4 ℃以3 000 r/min離心20 min獲得血清，測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)。肝臟通過蛋白質(zhì)印跡試驗測定靶蛋白的表達(dá)水平。

動物程序經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)科學(xué)學(xué)院動物護理與使用委員會批準(zhǔn)，符合CIOMS動物生物醫(yī)學(xué)研究的國際指導(dǎo)原則。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期藥物干預(yù)改善GDM小鼠的血脂水平檢測血清中HDL-C濃度，N組為(2.75±0.13)mmol/L，G組為(1.12±0.07)mmol/L，GI組為(2.31±0.03)mmol/L，GG組為(2.20±0.07)mmol/L，GM組為(2.22±0.08)mmol/L；5組比較，F(xiàn)=163.30，P<0.01。檢測血清中LDL-C濃度，N組為(1.64±0.30)mmol/L，G組為(4.52±0.34)mmol/L，GI組為(3.28±0.30)mmol/L，GG組為(3.34±0.20)mmol/L，GM組為(3.08±0.12)mmol/L；5組比較，F(xiàn)=45.47，P<0.01。檢測血清中TC濃度，N組為(1.68±0.06)mmol/L，G組為(5.34±0.08)mmol/L，GI組為(2.46±0.14)mmol/L，GG組為(2.62±0.05)mmol/L，GM組為(2.50±0.07)mmol/L；5組比較，F(xiàn)=855.00，P<0.01。檢測血清中TG濃度，N組為(1.33±0.22)mmol/L，G組為(3.62±0.28)mmol/L，GI組為(1.85±0.11)mmol/L，GG組為(2.00±0.08)mmol/L，GM組濃度為(1.90±0.04)mmol/L；5組比較，F(xiàn)=76.97，P<0.01。與N組比較，G組的LDL-C、TC和TG水平升高(P<0.01)，HDL-C降低(P<0.01)。 重要的是，這些指標(biāo)值在GI、GG和GM組中得到改善(P<0.05)，如圖1所示。

2.2 妊娠期藥物干預(yù)改善GDM小鼠的肝脂水平檢測肝臟中TC濃度，N組為(0.37±0.03)mmol/g，G組為(1.20±0.18)mmol/g，GI組為(0.38±0.04)mmol/g，GG組為(0.49±0.03)mmol/g，GM組為(0.47±0.04)mmol/g；5組比較，F(xiàn)=94.86，P<0.01。檢測肝臟中TG濃度，N組為(0.05±0.02)mmol/g，G組為(0.19±0.02)mmol/g，GI組為(0.07±0.01)mmol/g，GG組為(0.07±0.01)mmol/g，GM組為(0.07±0.03)mmol/g；5組比較，F(xiàn)=64.56，P<0.01。 其中GI，GG和GM組與正常對照組相似，表明在三種藥物干預(yù)下，TC和TG肝臟積聚受到抑制，如圖2所示。

2.3 妊娠期藥物干預(yù)改善GDM小鼠肝臟脂代謝乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)是脂肪酸合成所需關(guān)鍵酶，肝臟蛋白表達(dá)磷酸化乙酰輔酶 A 羧化酶(phosphorylation acetyl-CoA carboxylase, p-ACC)與ACC的比值，N組為(1.00±0.09)，G組為(0.23± 0.03)，GI組為(0.55±0.07)，GG組為(0.52±0.10)，GM組為(0.52±0.03)；5組比較，F(xiàn)=91.99，P<0.01。與GDM對照組相比，干預(yù)組用胰島素或格列本脲或二甲雙胍后p-ACC與ACC的比值升高，但低于正常對照組。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2, SREBP2)是肝臟膽固醇合成的重要關(guān)鍵酶，肝臟蛋白表達(dá)SREBP2與β-actin的比值，N組為(1.00±0.09)，G組為(2.20±0.18)，GI組為(1.01±0.14)，GG組為(0.96±0.14)，GM組為(0.89±0.17)；5組比較，F(xiàn)=83.39，P<0.01。與正常對照組相比，GDM組的肝組織中SREBP2的蛋白水平升高，但這種升高分別被胰島素或格列本脲或二甲雙胍完全抑制，與正常對照組無差別。如圖3所示。

圖2 妊娠期藥物干預(yù)改善產(chǎn)前GDM小鼠的肝脂水平

圖3 妊娠期藥物干預(yù)改善GDM小鼠肝臟脂代謝

A：p-ACC與ACC蛋白的表達(dá)；B：SREBP2蛋白的表達(dá)；C：p-ACC與ACC的比值；D：SREBP2與β-actin的比值；與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

藥物對GDM女性長期影響仍存在很多不確定性，包括這些藥物干預(yù)引起的積極的和不良的影響[4-5]。Huang et al[3]研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)能有效改善GDM母鼠的高血糖水平以及胰島素抵抗。GDM導(dǎo)致高血糖和胰島素抵抗，同時也伴隨脂代謝紊亂。

人群流行病學(xué)顯示糖尿病妊娠期血糖控制不良會影響脂質(zhì)代謝[6]。糖代謝紊亂，導(dǎo)致的血糖水平升高，肝糖原合成受損，糖異生增強可能增強脂質(zhì)在血液、肝臟中的代謝沉積。另外胰島素抵抗導(dǎo)致血漿中胰島素水平升高。而較高的血漿胰島素可抑制脂肪酸氧化，胰島素使脂肪酸氧化降低55%，脂肪分解降低71%，完全抑制細(xì)胞外脂肪酸再酯化。而改善的脂代謝可能與改善糖代謝紊亂及降低胰島素抵抗有關(guān)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)胰島素、格列本脲和二甲雙胍可以改善產(chǎn)前GDM母鼠的高血脂、高肝脂水平。從脂代謝的分子水平來看，ACC是脂肪酸合成所需關(guān)鍵酶。三種藥物分別干預(yù)可以有效抑制ACC活性，從而抑制GDM小鼠肝臟中ACC調(diào)節(jié)性脂肪合成。SREBP2調(diào)控膽固醇合成，三種藥物分別干預(yù)抑制GDM鼠肝臟中SREBP2水平升高(P<0.05)。肝臟脂質(zhì)合成的機制檢測表明藥物干預(yù)的GDM小鼠的血液和肝臟中的生化特征的一致性。三種降糖藥物對GDM小鼠妊娠期的分別干預(yù)能有效改善脂代謝。

三種藥物的作用機制是不同的，但結(jié)果顯示的作用區(qū)別不大，可能是研究所涉及蛋白表達(dá)的種類有限，應(yīng)作進一步的研究來深化藥物作用效果之間的差別。