格列本脲、二甲雙胍對GDM小鼠糖代謝的影響

余 婷，汪 洋，陳可洋

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)被定義為在妊娠期間發(fā)生或首先被識別葡萄糖調(diào)節(jié)受損，是妊娠期的一種很常見并發(fā)癥[1]。臨床上除胰島素之外，GDM的藥物治療選擇十分有限[2]。格列本脲和二甲雙胍治療2型糖尿病均有很好的降糖效果，但它們應用于GDM的作用效果和后續(xù)影響仍知之甚少[3]。格列本脲的主要作用是增加胰島素分泌，從而減少肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，間接改善胰島素敏感性[4]。而二甲雙胍是雙胍類藥物，是胰島素增敏劑[5]。據(jù)報道，二甲雙胍可降低肝臟葡萄糖輸出并改善胰島素敏感性[6]。該研究在孕期對GDM小鼠分別使用胰島素、格列本脲和二甲雙胍進行干預，旨在探討格列本脲、二甲雙胍對GDM小鼠的治療效果以及對小鼠產(chǎn)后1周和產(chǎn)后5周糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、小鼠抗β-actin購自美國Sigma公司，STZ用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，配成濃度為1%的STZ溶液；鹽酸二甲雙胍腸溶片購自貴州圣濟堂制藥有限公司；格列本脲片購自天津太平洋制藥有限公司；地特胰島素注射液購自丹麥諾和諾德公司；兔Anti-AKT抗體、兔Anti- p-AKT(Thr308)、兔Anti- p-AKT(Ser473)、兔Anti- FoxO1、兔Anti- p-FoxO1、兔Anti- PEPCK購自CST公司；兔Anti-G6Pase購自Thermo Scientific公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物有限公司。血糖儀、血糖試紙購自美國羅氏公司；凝膠掃描成像系統(tǒng)(Fine-do X6顯影儀)購自上海天能科技有限公司。

1.2 實驗動物及其處理從南京模式動物公司購買SPF級8周齡C57BL/6小鼠并按雌雄分類分別標記，其中雌鼠共100只，體質(zhì)量為17～20 g，雄鼠共50只，體質(zhì)量為20～24 g。試驗前動物自由進食飲水。小鼠生活環(huán)境為12 h白/12 h黑暗的晝夜節(jié)律，動物房溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±5)%。在上述環(huán)境適應1 周后，按2 ∶1雌雄合籠，第2天7:00對雌鼠進行陰栓檢查。查到陰栓的那天定為GD0，認為小鼠懷孕。懷孕后雌鼠改喂繁殖飼料(江蘇協(xié)同生物有限公司)，雄鼠依然進食基礎飼料。在GD6、GD7、GD8，懷孕雌鼠禁食8 h后，按40 mg/kg每天1次腹腔內(nèi)注射配制好的STZ溶液，隔1 d后，使用尾針刺法測量小鼠空腹血糖，≥11.1 mmol/L則認為GDM模型成功。選取GDM模型小鼠64只，按照隨機數(shù)字法分成4組(每組16只)：糖尿病對照組(G)、糖尿病胰島素組(GI)、糖尿病格列本脲組(GG)、糖尿病二甲雙胍組(GM)，另選16只正常健康的孕鼠做正常對照組(N)。在GD0、GD2、GD4、GD6、GD8、GD10、GD12、GD14、GD16、GD18(分娩前)檢測小鼠體質(zhì)量和空腹血糖水平。

1.3 藥物干預對于GI組的動物，從GD11至GD18(分娩前)治療，其由最初皮下注射7～10 U/kg地特胰島素注射液，并根據(jù)需要增加劑量，以確保血糖控制在11.1 mmol/L以下。對GM組的小鼠，使用鹽酸二甲雙胍腸溶片，劑量為300 mg/kg，用生理鹽水溶解，使用前用迷你振蕩器混勻后，給小鼠灌胃。從GD11至GD18(分娩前)治療，并且必要時每天增加劑量以確保血糖控制在11.1 mmol/L以下。對GG組的小鼠，使用格列本脲片，劑量為20 mg/kg，用生理鹽水配制成混懸液(格列本脲不易溶于生理鹽水)，使用前用迷你振蕩器混勻后，給小鼠灌胃。從GD11至GD18(分娩前)治療，并根據(jù)需要增加劑量，以確保血糖控制在11.1 mmol/L以下。

1.4 實驗動物干預后處理在GD18時，通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉，每組隨機選取8只孕鼠實施安樂死，立即收集肝組織，用液氮快速冷凍固定后儲存于-80 ℃冰箱待用。每組剩余的8只孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，直到自然分娩。每周測量1次小鼠體質(zhì)量和空腹血糖水平。在產(chǎn)后1周和5周，對自然分娩的母鼠施行葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance test，GTT)、胰島素耐量實驗(insulin tolerance test，ITT)。具體而言，禁食8 h后，通過向腹腔內(nèi)注射葡萄糖(2 mg/g)進行GTT，并使用血糖儀在注射之前和0.5、1、1.5、2、2.5 h之后通過尾部血液測量血糖濃度。通過將人胰島素(0.65 mU/g)注射到腹腔內(nèi)，對禁食4 h的小鼠進行ITT，并在注射之前和20、40、60、80、100、120 min之后通過尾部血液測量血糖濃度。然后在產(chǎn)后5周將母鼠安樂死，立即收集肝組織。肝組織用液氮快速冷凍固定后儲存于-80 ℃冰箱待用。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學動物倫理委員會批準，按照安徽醫(yī)科大學動物實驗規(guī)范進行。

1.5 Western blot檢測肝臟組織AKT、FoxO1、p-AKT、p-FoxO1、G6Pase、PEPCK的表達準確稱取50 mg肝臟組織，裂解后勻漿取上清液，BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，使用PVDF膜轉膜，一抗(小鼠抗β-actin、兔Anti-AKT抗體、兔Anti- p-AKT(Thr308)、兔Anti- p-AKT(Ser473)、兔Anti- FoxO1、兔Anti- p-FoxO1、兔Anti- PEPCK、兔Anti-G6Pase)室溫孵育2 h 或者4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育50 min。顯影A、B液1 ∶1配置后滴至PVDF膜，放入顯影儀中進行顯影。各條帶進行灰度掃描，對各灰度值進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 格列本脲和二甲雙胍對GDM小鼠體質(zhì)量、血糖的影響GDM造模成功的4組小鼠均表現(xiàn)出各種GDM癥狀，多食多尿(表現(xiàn)在食物、飲水消耗較快，墊料浸濕也較快)且體質(zhì)量較輕。而N組則生長狀態(tài)良好。由圖1A可見，4組GDM模型小鼠的體質(zhì)量均比N組小鼠的體質(zhì)量低(F=18.65，P<0.01)。與G組相比，GI、GG、GM組小鼠的體質(zhì)量均有增加。如圖1B所示，GDM造模成功的4組小鼠的空腹血糖水平在GD10左右達到最大值，在G11開始使用胰島素、格列本脲和二甲雙胍藥物干預后，GI、GG、GM組小鼠的空腹血糖水平都表現(xiàn)出了不同程度的下降。與N組相比，G組小鼠的空腹血糖水平從GD8開始升高，為(8.58±0.48)mmol/L，在GD18達到高峰，為(29.60±0.71)mmol/L。與G組比較，GI組、GG組、GM組小鼠的血糖水平在用藥后均有降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=419.20，P<0.01)。

2.2 格列本脲和二甲雙胍對GDM小鼠肝臟中相關蛋白的影響與G組相比，GI、GG和GM組分別采用胰島素、格列本脲和二甲雙胍3種干預措施，AKT活性增強(p-AKT473和p-AKT308)，達到N組水平，差異有統(tǒng)計學意義(F=42.66，P<0.01；F=27.53，P<0.01)。見圖2A。與G組相比，GI、GG和GM組p-FoxO1與FoxO1的比值升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=105.60，P<0.01)。見圖2B。Western blot顯示，GDM模型小鼠的肝臟中G6Pase和PEPCK蛋白水平增加。而與G組相比，GI、GG和GM組均顯示G6Pase和PEPCK蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=57.40，P<0.01；F=21.91，P<0.01)。見圖2C。

2.3 格列本脲和二甲雙胍對產(chǎn)后0～5周母鼠體質(zhì)量、血糖的影響與N組相比，G組的小鼠體質(zhì)量降低，而GI、GG和GM組的小鼠體質(zhì)量減輕得到了緩解(F=19.73，P<0.05)。見圖3A。與N組相比，GDM模型小鼠的空腹血糖水平增加(F=630.10，P<0.01)。見圖3B。表明經(jīng)過干預GDM模型小鼠從產(chǎn)后1周開始血糖水平急劇上升，最終在產(chǎn)后4～5周之后達到與未處理的G組小鼠相同的水平。

2.4 格列本脲和二甲雙胍對產(chǎn)后1周母鼠GTT、ITT的影響GTT和ITT中，GDM小鼠表現(xiàn)出了葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗。見圖4A、B。與N組小鼠相比，在G組中觀察到GTT和ITT中更高的血漿葡萄糖濃度-時間曲線(曲線下面積，area under the curve，AUC)。隨后的胰島素、格列本脲和二甲雙胍治療分別使GI、GG、GM組中的GTT和ITT的AUC值降低(F=278.40，P<0.01；F=642.10，P<0.01)。見圖4A、B。

圖1 GDM小鼠體質(zhì)量和血糖的變化

圖2 格列本脲和二甲雙胍分別干預后GDM小鼠肝臟中各蛋白的水平

A：p-AKT308/AKT和p-AKT473/AKT；B：p-FoxO1/FoxO1；C：G6Pase/β-actin和PEPCK/β-actin ；與N組比較：**P<0.01；與G組比較：##P<0.01

圖3 產(chǎn)后母鼠體質(zhì)量和血糖的變化

2.5 格列本脲和二甲雙胍對產(chǎn)后5周母鼠GTT、ITT的影響在GTT中，與N組小鼠相比，G、GI、GG、GM組中均觀察到更高的AUC，差異有統(tǒng)計學意義(F=339.30，P<0.01)。見圖5A。與N組小鼠相比，在G、GI、GG、GM組中均觀察到ITT中更高的AUC，差異有統(tǒng)計學意義(F=105.90，P<0.01)。見圖5B。

圖4 孕期格列本脲和二甲雙胍分別干預對產(chǎn)后1周母鼠GTT、ITT的影響

圖5 孕期格列本脲和二甲雙胍分別干預對產(chǎn)后5周母鼠GTT、ITT的影響

A：p-AKT308/AKT和p-AKT473/AKT；B：p-FoxO1/FoxO1；C：G6Pase/β-actin和PEPCK/β-actin；與N組比較：**P<0.01；與G組比較：##P<0.01； 與GG組比較：$$P<0.01

2.6 格列本脲和二甲雙胍對產(chǎn)后5周母鼠肝臟中相關蛋白的影響與G組相比，產(chǎn)后5周的GI、GG和GM組AKT活性(p-AKT473和p-AKT308)沒有變化，低于N組，差異有統(tǒng)計學意義(F=135.20，P<0.01；F=109.60，P<0.01)。見圖6A。另外，F(xiàn)oxO1的活性沒有變化，低于N組，差異有統(tǒng)計學意義(F=37.79，P<0.01)。見圖6B。這些結果與圖2A、2B中顯示的改善完全相反。與圖2C相比，GI、GG和GM組分別在產(chǎn)后5周時，G6Pase和PEPCK回到與未干預的GDM對照小鼠相同的水平，高于 N組，差異有統(tǒng)計學意義(F=55.80，P<0.01；F=100.60，P<0.01)。見圖6C。

3 討論

在本研究中，GDM小鼠模型是從GD8開始表現(xiàn)出血糖濃度的升高，模擬了在懷孕期間，人類從妊娠中期開始發(fā)生的GDM。此外，雖然本研究的GDM模型是由低劑量STZ誘導的，一些學者認為它對胰腺β細胞有毒性[7]，但是本研究中GDM小鼠的高血糖癥可以被格列本脲(胰島素分泌增強劑)改善，這表明GDM小鼠模型的胰島素分泌功能良好，未被破壞。

本研究顯示格列本脲和二甲雙胍在維持懷孕期間小鼠的空腹血糖穩(wěn)定方面與胰島素一樣有效，這些結果與人群研究是一致的[8-9]。本研究表明，在懷孕期間，經(jīng)二甲雙胍、格列本脲分別干預的GDM小鼠的肝組織中的蛋白質(zhì)水平恢復到正常水平，例如p-AKT308 (Thr308)、p-AKT473 (Ser473)、p-FoxO1、G6Pase和PEPCK。AKT磷酸化變?yōu)閜-AKT即為AKT的激活，AKT的激活是調(diào)節(jié)肌肉、脂肪細胞、肝臟中糖原合成和抑制糖異生所必需的[10]。本研究中干預組小鼠p-AKT308 (Thr308)、p-AKT473 (Ser473)的增加，證實了格列本脲或二甲雙胍可以通過增加AKT的激活，進而抑制糖原合成酶。高血糖是肝臟葡萄糖輸出增加和糖尿病患者外周葡萄糖利用率降低的結果，PEPCK和G6Pase是參與調(diào)節(jié)肝臟糖異生的兩種關鍵酶[11]，而FoxO1可以調(diào)節(jié)PEPCK和G6Pase的活性[12]。用格列本脲或二甲雙胍治療減弱了GDM小鼠肝臟中PEPCK和G6Pase的表達的異常升高，這說明格列本脲或二甲雙胍的干預抑制了PEPCK和G6Pase的表達，進而抑制糖異生。

葡萄糖刺激胰腺分泌胰島素，從而提高血糖的利用率。然而，GDM小鼠對胰島素不敏感，導致了對葡萄糖的利用下降，因此它們的血糖水平仍然較高。糖尿病小鼠葡萄糖耐量降低可能導致GTT血糖水平較高，胰島素敏感性降低可能導致ITT血糖水平較高[13]。因此，GTT廣泛應用于評估葡萄糖耐量，而 ITT則廣泛應用于評估胰島素敏感性[14]。母鼠產(chǎn)后1周，觀察到格列本脲和二甲雙胍干預組GTT和ITT中的AUC比G組低，這說明在產(chǎn)后1周格列本脲和二甲雙胍對母鼠葡萄糖耐受、胰島素抵抗的改善仍持續(xù)存在；對于產(chǎn)后5周的小鼠，格列本脲和二甲雙胍對GDM小鼠的干預效果消失，GTT和ITT的曲線趨勢與GDM對照組一致，這說明母鼠發(fā)生了葡萄糖耐量降低和胰島素敏感性降低。并且與G組相比，GDM治療組產(chǎn)后5周母鼠肝組織中p-AKT473、p-AKT308、p-FoxO1、G6Pase和PEPCK蛋白水平均沒有變化。以上指標均顯示，干預組的小鼠在產(chǎn)后5周都表現(xiàn)出2型糖尿病小鼠所具有的糖代謝特征。這表明雖然格列本脲或二甲雙胍可以改善GDM小鼠在妊娠期和產(chǎn)后短期的糖代謝異常，但不能降低GDM小鼠在產(chǎn)后發(fā)展為2型糖尿病的風險。

綜上所述，GDM不僅會引起小鼠孕期的葡萄糖耐量降低和胰島素抵抗，而且會對小鼠產(chǎn)后的葡萄糖代謝產(chǎn)生強烈影響。而妊娠期間格列本脲或二甲雙胍的干預可通過改善妊娠期和產(chǎn)后1周的GDM小鼠肝臟中的胰島素敏感性來改善葡萄糖代謝，但不能改善產(chǎn)后5周小鼠的胰島素抵抗和葡萄糖代謝。