代謝組學生物標記物在兒童支氣管哮喘中的作用

陳曉彬，萬力生*，李佳曦，陳爭光

（1.遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518026）

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。該病可發(fā)生于任何年齡，但以小兒較為常見，且是常見的兒科急癥之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)哮喘疾病患兒的治療費用成為了各個國家衛(wèi)生部門支出中相當龐大的一部分，該病對兒童的身心健康產(chǎn)生了嚴重的危害。因此，哮喘疾病是關聯(lián)個體或者特殊群體而存在的問題，逐漸引起政府及衛(wèi)生事業(yè)研究者的高度重視的社會問題。

代謝組學是近年來一門新興的學科，以分析機體產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物（分子量＜1 000 Da），了解這些小分子物質在某種疾病狀態(tài)下的終末變化過程，進而揭示其在該疾病狀態(tài)下的動態(tài)過程及調控規(guī)律[3]。該學科更加強調應用整體及動態(tài)的觀點來研究疾病，這與中醫(yī)學的整體、系統(tǒng)和辨證論治思維高度契合。在支氣管哮喘患者中，不同疾病階段其代謝終末產(chǎn)物可能存在一定差異。另外，該檢測手段具有更高的準確性及靈敏度，并將統(tǒng)計學分析融入其中，通過一次檢測分析可找出多個可能與疾病相關的生物標志物。因此，可將其作為該病的生物標記物，動態(tài)的了解該病的發(fā)生、發(fā)展、嚴重程度評估、療效評價及預后。

中醫(yī)學辨證論治為中醫(yī)之根本，從中醫(yī)的角度出發(fā)，哮喘疾病的機制可從“風邪”論、“痰”論、“痰瘀互結”論、“腑臟”論等多個方面進行分析[4]。疾病的證型主要依靠患兒疾病的臨床表現(xiàn)，除外還需依靠醫(yī)者個人豐富的臨床診療經(jīng)驗進行鑒別，中醫(yī)證型的分辨對小兒哮喘疾病的診療及機制研究提供了更廣闊的思路，但是在小兒支氣管哮喘疾病的病因和機制研究中缺乏一定的客觀標準，中醫(yī)理論與代謝組學研究方法的結合，為中醫(yī)學在小兒支氣管哮喘的病因及機制研究中開辟了新的思路。

1 代謝組學的定義及研究技術

代謝組學（metabonomics）是由 Nicholson 及其同事于1999年首次在已有的基因、轉錄和蛋白組學之后的一門創(chuàng)新性組學分支[5]，主要是通過分子生物學技術對低分子代謝產(chǎn)物（一般分子量小于1 000）進行定性定量分析。針對不同的研究個體以及研究結果，可以大致將代謝組學分析層次總結為代謝靶向目標分析、代謝指紋圖譜分析、代謝輪廓分析以及代謝組學分析4個研究層次[6]。其研究流程包括樣品的采集和處理、定性定量分析、數(shù)據(jù)處理、相關生物標記物繼代謝途徑的尋找、生物學意義的獲取等[7]。每一種技術都有各自的有點，為了更大地發(fā)揮其優(yōu)點，把多種技術聯(lián)合應用到對生物代謝的分析中，其中以核磁共振、液相色譜—質譜聯(lián)用技術、氣相色譜—質譜聯(lián)用技術應用最為廣泛[8]。

2 代謝組學中生物標記物的研究進展

代謝組學的研究標本具有多樣性，人本身作為一個不斷運行的機體，參與機體代謝活動的各類組織液如血液、尿液、唾液等都處于動態(tài)的更替中，包括機體的細胞內液、細胞中微小結構以至于機體組織等都含有大量的機體代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物在機體受到外界刺激發(fā)生疾病或創(chuàng)傷的狀態(tài)下，都可以適時的反應出機體內的微觀變化并體現(xiàn)于整體，為研究疾病的發(fā)生、發(fā)展提供大量信息[9-10]。尿液本身作為機體通過復雜的轉換與代謝后排出體外的一類“廢液”，標本收集簡單無創(chuàng)，臨床較易獲得，用于疾病的研究相對簡便且更有意義。CARRARO S等[11]采用液相色譜質譜聯(lián)用儀分析，觀察哮喘組大鼠與正常組大鼠尿液的代謝組分變化，發(fā)現(xiàn)乳酸、檸檬酸等代謝產(chǎn)物在肝郁證哮喘組大鼠的尿液中較正常組是減少的，而乙酰乙酸、肌酸酐等 7 種代謝產(chǎn)物的含量則是增多的，從而初步分析出能夠反映哮喘組代謝特征的生物標記物，為肝郁證哮喘的作用機制、作用靶向點提供了依據(jù)。體質存在能量代謝、氨基酸代謝及糖代謝的差異。

呼氣冷凝液是人們呼氣后產(chǎn)生的一種高度稀釋的體液，其檢測具有無創(chuàng)傷、易操作、可反復進行等優(yōu)點，在兒童的肺部疾病研究中高度可行?，F(xiàn)已有研究證實呼氣冷凝液的 NMR 譜可以區(qū)分出哮喘兒童和健康兒童，其精確度為 86%。IBRAHIM B等[12]通過呼氣冷凝集液的 NMR 分析哮喘患者與健康組小分子代謝產(chǎn)物的差異性分布發(fā)現(xiàn)，不同表型的哮喘其小分子代謝產(chǎn)物分布存在差異性，因此可分為嗜酸性粒細胞增多型、中性粒細胞增多型、哮喘控制型和使用糖皮質激素治療的哮喘型等。

綜上所述，在支氣管哮喘發(fā)作的病程中，獲得生物體體液或血液等樣本，利用代謝組學技術進行檢測其中的生物標記物，尋找出具有生物學意義的差異性標志物，通過這些差異性代謝產(chǎn)物找到與之相對應的代謝通路，經(jīng)過進一步研究與分析其中的關系，成為甄別中醫(yī)證型的客觀性向導。目前越來越多的學者已發(fā)現(xiàn)一些與支氣管哮喘疾病發(fā)作機制相關的代謝通路及特異性生物標記物，這些研究的成果都為進一步的探索支氣管哮喘的病理生理機制，以及對指導個體的治療和預防有著極其重要的意義。

3 代謝組學技術在支氣管哮喘疾病中的研究

隨著醫(yī)學研究技術的進步，代謝組學這項新興研究分析技術的快速發(fā)展，逐漸形成了從上至下的系統(tǒng)生物學研究方法，廣泛運用于各種疾病的研究。收集支氣管哮喘兒童的外周血液、大小便、呼氣冷凝液、肺泡灌洗液等標本并測定，以發(fā)現(xiàn)其特定的生物標記物，通過對其進行定性及定量分析，尋找與標記物相關的代謝途徑，并分析其發(fā)病過程中特定標志物的變化過程，最終獲得其生物學意義及可能存在的發(fā)病機制，為該病的診治、疾病評估、療效分析及預后提供理論依據(jù)。

VERCELLI D[13]通過構建小鼠哮喘模型表達芯片譜精氨酸酶I 和精氨酸酶II 濃度高低與哮喘的炎癥介質IL-4 和IL-13 表達具有相關性，因此可推斷哮喘的發(fā)病機制可能與精氨酸通路密切相關。PETERSGOLDEN M等[14]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝通路與支氣管哮喘急性發(fā)作高度相關，并可作為疾病嚴重程度的特異性標志物。李永霞等[15]通過檢測支氣管哮喘患者急性發(fā)作期與緩解期兩個不同時期患者血清中的8-異前列腺素水平，證實急性發(fā)作期血清中的 8-異前列腺素明顯升高，而經(jīng)治療后其水平可顯著降低，但都仍高于正常組患者。因此，8-異前列腺素可作為評價該病嚴重程度及療效的生物標志物 。

4 代謝組學技術在支氣管哮喘中醫(yī)方向的研究

中醫(yī)證候是指對某種疾病在某一發(fā)展階段的起病原因、發(fā)生機制、疾病性質等的概括性描述。利用代謝組學，可以更加完全的反映出疾病的內在圍觀變化，使“證候”得到客觀、定性、定量的描述，從而促進中醫(yī)證候本質的研究。由于生物體在不同生理及病理階段有著特殊的代謝模式，有學者運用代謝組學技術研究中醫(yī)證侯，找到與支氣管哮喘發(fā)病機制可能相關的代謝通路，篩選出與“證型”相關的特異性生物標記物，為中醫(yī)證型的區(qū)分提供了理論基礎。代謝組學采用了一種接近身體內環(huán)境的方法，利用身體機能受到外界刺激而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及廢物的變化，對生物體進行的一種無損傷研究，打破了傳統(tǒng)檢驗方法的局限性，利用某一些特異性的生物標記物，找到完整的代謝通路，建立起一個相對完整的疾病發(fā)生時生物體的病理生理改變，更加系統(tǒng)的闡述了疾病的發(fā)生、發(fā)展以及對治療和防治的重要意義，這與中醫(yī)學的“整體觀”和“動態(tài)觀” 相似，代謝組學作為一種新的研究手段與中醫(yī)學相結合，微觀上從小分子代謝物，宏觀上從整體代謝通路延伸至疾病機制，為中醫(yī)證候的甄別添加了更具有說服力的客觀證據(jù)。

牛曉曼等[16]運用1-HNMR代謝組學方法研究脾虛型痛風患者糞便中的生物標記物，得出與正常健康人相比較，其中丁酸、丙氨酸、?；撬岬壬飿擞浳锖坑忻黠@變化，與非脾虛型的痛風患者相比，其中異亮氨酸、亮氨酸等代謝物含量具有差異。周賢梅等[17]選擇肺癌痰濕蘊肺證、氣陰兩虛證患者與健康志愿者的呼氣冷凝液為標本，利用氣相色譜—質譜(GC-MS)技術分析呼氣冷凝液代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了 9 種潛在的可能與腫瘤疾病相關的代謝標志物，其中 3 種為2個實驗組特有化合物，6 種為3個實驗組共有化合物；3-氨基-2-苯甲酰基-4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩為痰濕蘊肺組特有化合物，1-(苯基磺?；?吡咯為氣陰兩虛組特有化合物。得出呼氣冷凝液中存在著對肺癌具有診斷意義的代謝產(chǎn)物，肺癌不同中醫(yī)證型的臨床客觀化指標的研究的可能性。陶嘉磊等[18]運用氣相色譜與質譜聯(lián)用技術（GC-MS/MS），分析小兒支氣管哮喘發(fā)作期痰熱阻肺證、非痰熱阻肺證尿液代謝物，發(fā)現(xiàn)與非痰熱阻肺證患兒相比，痰熱阻肺證患兒尿液中的草酸、L-蘇氨酸、嘧啶等 9 種物質含量下降，主要涉及戊糖磷酸途徑，肌醇磷酸代謝等 4 條代謝通路，從而得出，支氣管哮喘發(fā)作期不同證型間存在代謝標記物與代謝通路基礎。吳澤明等[19]通過液相色譜—質譜聯(lián)用技術對維吾爾醫(yī)異常黑膽質證哮喘患者的血清中的代謝產(chǎn)物進行研究，篩選出可能與異常黑膽汁型哮喘發(fā)生相關的 15 個代謝產(chǎn)物，是維吾爾醫(yī)在支氣管哮喘的診治過程中有了可靠的依據(jù)。陳黎等[20]利用GC/MS代謝組學技術通過研究小兒哮喘患者尿液中的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)與正常小兒相比，哮喘患兒尿液中的磷酸鹽、L-蘇氨酸、L-脯氨酸等18種代謝物存在明顯的差異，通過分析代謝通路，得出能量代謝、氨基酸代謝等代謝通路可能與哮喘疾病發(fā)病機制相關。茍小軍等[21]采用氣相色譜、質譜技術檢測兒童哮喘肺脾氣虛型、氣陰兩虛型患者以及正常兒童的尿液中中小分子代謝物，利用代謝物譜庫得出兒童哮喘2種“證型”患者間尿液中的丁酸、磷酸鹽、L-蘇氨酸、肌酐、甘氨酸、D-葡萄糖、馬尿酸、假尿苷的相對含量存在顯著差異，這些代謝物與能量代謝、腸道菌群代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝異常相關，它們是區(qū)分這2種中醫(yī)證型的潛在生物標記物。

綜上，代謝組學技術從微觀分析到宏觀概括也可以與中醫(yī)理論相結合，應用于不同證型的支氣管哮喘患兒的研究，為哮喘疾病的辨證論治、探索病癥間的內在聯(lián)系以及對疾病的預防提供了更深層次的依據(jù)。

5 小結

兒童支氣管哮喘是兒童常見的急癥之一，其反復發(fā)作仍是危害兒童身心健康的重要原因。近年來兒童哮喘的發(fā)病率及致殘率均有顯著升高，因此，早期診斷及合理的管理該疾病對降低其致殘率至關重要。目前，在國內外都已經(jīng)有眾多學者開始利用代謝組學技術進行支氣管哮喘疾病的研究，而中醫(yī)是屬于祖國的特色醫(yī)學，代謝組學生物標志物可幫助解決這一關鍵問題，通過對哮喘患者的代謝廢物或代謝產(chǎn)物的特定生物標志物進行檢測，可了解該病的診斷、分析、疾病活動度、嚴重程度及療效等，更簡潔、方便及無創(chuàng)的對哮喘患者進行管理，這將對該類患者的診療及管理起到至關重要的作用。