五味子多糖對2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子的影響及其作用機(jī)制

杜興旭，喬子敬，楊 碩, 許智瑩, 楊 波, 李 賀, 陳建光, 王春梅

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 吉林 132002；2. 北華大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus, T2DM)的主要病理特征是胰島素抵抗(insulin resistance, IR)和胰島β細(xì)胞功能衰竭。隨著對T2DM和IR研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)已成為IR、胰島β細(xì)胞功能減退、代謝綜合征和心血管并發(fā)癥的“共同土壤”[1]。2011年，DONATH 等[2]研究表明：T2DM是一種炎癥性疾病。大量研究[3-5]表明：炎癥因子如白細(xì)胞介素類、 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)和核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)等可以通過血液和(或)旁分泌的作用影響胰島素(insulin,INS)的敏感性和胰島β細(xì)胞功能，因此抑制上述炎癥因子能夠起到改善IR、保護(hù)胰島β細(xì)胞和降低血糖的作用[6-7]。

五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]是著名的長白山道地藥材，具有酸、苦、甘、辛和咸5種藥性，且以酸味為主，能補益五臟，是治療糖尿病之上品[8]。近年來研究[9-10]顯示：五味子治療糖尿病效果明顯，不僅可以降低糖尿病大鼠血糖和血脂水平，還能提高靶組織對INS的敏感性，延緩胰島β細(xì)胞凋亡，改善β細(xì)胞的功能。然而，五味子發(fā)揮抗糖尿病作用的具體成分和機(jī)制尚不清楚。多糖是五味子的主要活性成分之一，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和保護(hù)肝臟等功效[11-13]。本課題組前期研究[14]表明：五味子多糖(Schisandra chinensis polysaccharide, SCP)對鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和四氧嘧啶誘導(dǎo)的小鼠糖尿病均具有明顯的降血糖作用，且能降低血清中TNF-α和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β， IL-1β)水平。為了進(jìn)一步探討SCP對T2DM的治療作用及其與抗炎癥反應(yīng)的關(guān)系，本研究采用高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ建立T2DM大鼠模型，觀察SCP對T2DM的治療作用，并探討SCP的降糖作用是否與其抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，為五味子的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器 雄性Wistar大鼠70只，體質(zhì)量為180～230 g，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動物許可證號：SCXK(吉)2016-0003。大鼠采取分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫21℃～24℃，濕度40%～60%，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實驗。實驗大鼠的普通飼料和高脂飼料均購于吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，高脂飼料含碳水化合物53.3%、酪蛋白20.0%、豬油10.0%、蔗糖5.0%、膽固醇2.0%和其他9.7%。

SCP由東北師范大學(xué)生命科學(xué)中心制備[13]。STZ購自美國Sigma-Aldrich公司，葡萄糖試劑盒由中生北控生物科技股份有限公司提供， INS放射免疫分析試劑盒由上海朗頓生物科技有限公司提供，大鼠白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、CRP、IL-1β、TNF-α和NF-κB ELISA檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。S10手提式高速分散器(寧波新生生物科技股份有限公司)，InfiniteM 200全自動酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司)，MH-1微量振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2 實驗動物分組、造模和處理 Wistar大鼠70只，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，飼喂普通飼料；其余60只大鼠飼喂高脂飼料4周后一次性腹腔注射STZ 30 mg·kg-1，建立T2DM模型。正常對照組大鼠給予等體積枸櫞酸緩沖液。1周后檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG≥7.0 mmol·L-1表示造模成功[15]。將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為模型組及低、中和高劑量SCP組，每組10只。正常對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，低、中和高劑量SCP組分別給予25、50和100 mg·kg-1SCP灌胃，每天1次，連續(xù)8周。

1.3 口服葡萄糖耐量實驗 (oral glucose tolerance test, OGTT) 各組大鼠給藥治療8周后進(jìn)行OGTT，實驗前各組大鼠禁食 12 h，灌胃給予葡萄糖2.5 g·kg-1，分別于灌胃前(0 min)及灌胃后30、60和120 min 采集大鼠眼內(nèi)眥部血樣，測定血糖水平，計算血糖曲線下面積(AUC)。公式為：血糖AUC=(C1+C2)×(t1+t2)/2，C1和C2代表不同時間點的血糖濃度，t1和t2代表不同的檢測時間點[16]。

1.4 大鼠FBG和INS水平檢測 末次灌胃給藥后，大鼠被禁食12 h，采用烏拉坦(1 g·kg-1)進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，3 500 r·mim-1離心10 min，分離血清于-80℃保存待用。采用葡萄糖氧化酶法檢測大鼠FBG水平，放射性免疫分析法檢測血清INS水平，具體操作方法參照試劑盒說明書，并計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，ISI= Ln(FBG×INS)-1[15]。

1.5 大鼠血清中炎癥因子水平檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、CRP、IL-1β、TNF-α 和NF-κB水平，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.6 HE染色觀察大鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 快速取出上述各組大鼠胰腺組織，并置于10%中性甲醛溶液中固定24 h以上，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成厚度為5 μm 的切片，行常規(guī)HE染色。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中FBG和INS水平及ISI 與正常對照組比較，模型組大鼠FBG水平明顯升高(P<0.01)，INS水平和ISI明顯降低(P<0.05或P<0.01)，提示T2DM大鼠建模成功。與模型組比較，各劑量SCP組大鼠血清中FBG水平均明顯降低 (P<0.05或P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.05或P<0.01)；各劑量SCP組大鼠血清中INS水平和ISI均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，但仍低于正常對照組(P<0.05)。與低劑量SCP組比較，中和高劑量組大鼠FBG水平明顯降低(P<0.05)，高劑量SCP組大鼠血清中INS水平明顯升高(P<0.05)。見表1 。

表1 各組大鼠血清中FBG和INS水平及ISITab.1 Levels of FBG and INS in serum and ISI of rats in various groups

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;#P<0.05vslow dose of SCP group.

2.2 各組大鼠糖耐量水平和血糖AUC 正常對照組、模型組和各劑量SCP組大鼠在葡萄糖注射后30 min血糖水平達(dá)峰值。在接下來的90 min內(nèi)，正常對照組大鼠血糖水平逐漸下降，在注射120 min后基本恢復(fù)到正常血糖水平；模型組大鼠血糖水平緩慢下降，其血糖水平與正常對照組、各劑量SCP組比較一直維持在較高水平。此外，模型組大鼠血糖AUC明顯高于正常對照組；各劑量SCP組大鼠血糖AUC遠(yuǎn)低于模型組。見圖1 。

2.3 各組大鼠血清中炎癥因子水平 與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α和 NF-κB水平均明顯升高(P<0.01)，各劑量SCP組大鼠血清中IL-1β和IL-6水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，低、中劑量SCP組大鼠血清中CRP、TNF-α 和 NF-κB水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，而高劑量SCP組大鼠血清中CRP、TNF-α 和 NF-κB水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，各劑量SCP組大鼠血清中IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α 和 NF-κB水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

1:Normal control group;2:Model group;3:Low dose of SCP group;4:Middle dose of SCP group;5:High dose of SCP group.
圖1 各組大鼠糖耐量水平(A)和血糖AUC(B)
Fig.1 Glucose tolerance levels(A) and AUC of blood glucose(B) of rats in various groups

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平Tab.2 Levels of inflammatory factors in serum of rats in various groups

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.4 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 正常對照組大鼠胰島形狀規(guī)則，呈圓形或橢圓形團(tuán)索狀，邊界清晰，胰島內(nèi)β細(xì)胞分布均勻，排列緊密，胞漿豐富。模型組大鼠胰島萎縮，結(jié)構(gòu)不清、邊緣不整；各劑量SCP組大鼠胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯減少，排列稀疏，隨著SCP給藥劑量的增加，各劑量SCP組胰島邊界逐漸清晰，細(xì)胞數(shù)目明顯增加，細(xì)胞形態(tài)趨于完好。見圖2(插頁三)。

A:Normal control group; B: Model group; C: Low dose of SCP group; D: Middle dose of SCP group; E: High dose of SCP group.
圖2 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)表現(xiàn) (HE,×200)
Fig.2 Pathomorphology of pancreas tissue of rats in various groups (HE， ×200)

3 討 論

五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解除因體液不足和糖尿病引起的口渴的功能。1993年張志軍[17]首次明確了五味子對臨床糖尿病患者具有改善血糖和糖化血紅蛋白(HbA1C)的作用。研究[18]顯示：SCP能明顯降低糖尿病模型小鼠體質(zhì)量，減輕煩渴、多尿和高血糖表現(xiàn)，促進(jìn)肝糖原生成，改善小鼠糖尿病的脂質(zhì)代謝紊亂。本研究結(jié)果也顯示：SCP可明顯降低高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠FBG，升高血清INS水平，提高ISI，顯示出對T2DM良好的治療效果。

T2DM發(fā)病的主要環(huán)節(jié)是IR和胰島β細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致不同程度的INS缺乏。本研究采用高脂高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠，誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)IR，并聯(lián)合應(yīng)用小劑量STZ破壞胰島β細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)展為類似于人類T2DM的動物模型。本研究中胰島病理及OGTT檢測結(jié)果顯示：模型組大鼠胰島受損、萎縮，葡萄糖耐量明顯降低，而SCP治療可明顯改善T2DM大鼠的胰島病理學(xué)變化和葡萄糖耐量，改善了IR。

炎癥反應(yīng)參與T2DM的發(fā)生發(fā)展過程[19-20]。研究[21-23]顯示：在肥胖者脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞的浸潤，促進(jìn) IL-6和TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而干擾INS信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。巨噬細(xì)胞從M2型到M1型的轉(zhuǎn)變對T2DM胰島功能紊亂起著至關(guān)重要的作用[24-25]。此外，M1型巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子刺激胰島β細(xì)胞分泌IL-1β 等，從而加速胰島炎癥[26]。因此，直接靶向炎癥對血糖控制、β細(xì)胞功能和IR均具有有益的影響。研究[27-28]證實：IL-1受體拮抗劑或抗IL-1β的單克隆抗體可降低嚙齒類動物和人類的高血糖及炎癥細(xì)胞因子水平，并減輕巨噬細(xì)胞浸潤。水楊酸前體藥物雙水楊酸酯通過抑制NF-κB信號通路，進(jìn)而降低T2DM患者的血糖、HbA1C和CRP水平[29]。高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的T2DM動物模型通常伴有炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示：應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ一次性腹腔注射建立的T2DM模型大鼠血清中炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-1β、CRP、TNF-α和NF-κB水平明顯升高，而使用SCP治療后，大鼠血清中IL-6、CRP、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均明顯降低，提示SCP治療能夠抑制T2DM大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮改善IR和修復(fù)受損的胰島β細(xì)胞的作用，進(jìn)而發(fā)揮降血糖的作用。

綜上所述，SCP可降低T2DM大鼠FBG水平，提高INS水平，改善IR，減輕胰島損傷。SCP對T2DM有治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果為五味子的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了理論基礎(chǔ)。