實驗性種植體周圍炎小鼠模型的建立及TNF-α在模型小鼠牙齦組織中的表達

宋續(xù)軍，張 倩，王少磊，柏 娜，劉 杰

(1. 青島大學附屬醫(yī)院口腔修復科，山東 青島 266003;2. 青島大學口腔醫(yī)學院，山東 青島 266003)

種植體周圍炎是與種植體功能喪失相關(guān)的不可逆炎癥反應，其特征是軟組織感染和周圍骨質(zhì)流失，最終導致種植體的脫落[1]。實驗動物模型是研究疾病發(fā)病機制和發(fā)展的重要工具。目前已經(jīng)通過飼喂含菌飼料法[2]、脂多糖注射法[3]和結(jié)扎法[4]建立了實驗性種植體周圍炎模型。動物實驗[5-6]結(jié)果表明：種植體周圍炎與牙周炎相似，其發(fā)生與菌斑定植有關(guān)聯(lián)。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是牙周病發(fā)展過程中起破壞組織作用的主要炎癥因子，其可促進炎癥細胞進入感染部位。研究[7]表明：種植體周圍炎齦溝液中炎癥因子TNF-α水平較健康種植體組和對照組齦溝液中TNF-α水平升高，表明TNF-α可通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)免疫細胞，破壞骨組織，發(fā)生骨吸收。目前針對種植體周圍炎的動物實驗研究主要集中于犬和小型豬等大型哺乳動物[8-9]，但其費用、畜牧條件以及抗體試劑、遺傳篩檢限制等因素均限制了研究的進行[10-11]。本研究擬應用即刻種植及結(jié)扎誘導法建立實驗性種植體周圍炎小鼠模型，探討TNF-α在實驗性種植體周圍炎模型小鼠牙齦組織中的表達，闡明其在種植體周圍炎中的致病作用，以期為種植體周圍炎動物模型的建立提供新思路，并為該類疾病治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 4周齡雄性C57BL/6J小鼠18只，體質(zhì)量16～19 g，購自濟南朋悅動物中心，動物許可證號：SCXK(魯)20190003。在實驗期間小鼠定時喂軟質(zhì)飲食。Trizol試劑(美國Ambion公司)，50×ROX Reference Dye 2和 SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司，SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒(美國Invitrogen公司)，dNTP(天根生化科技有限公司)，Ribonuclease Inhibitor(北京全式金生物)。螺旋型種植體和定制式驅(qū)動器(山東威高集團有限公司)，顯微組織鑷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，5-0絲線(美國Johnson & Johnson公司)，微計算機斷層掃描(Micro-CT)系統(tǒng)(瑞士SCANCO Medical公司)，手術(shù)放大鏡(德國HEINE公司)，組織勻漿器(美國Omni International公司)。

1.2 動物分組及動物模型建立 實驗前將18只小鼠隨機分為空白組、對照組和模型組，每組6只，均飼養(yǎng)在青島大學動物實驗管理中心的SPF級單元中，動物管理符合動物保護條例。3組小鼠在手術(shù)之前，腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100 mg·kg-1)和賽拉嗪(5 mg·kg-1)對小鼠進行全身麻醉。所有手術(shù)均使用手術(shù)放大鏡在標準無菌條件下進行。使用顯微組織鑷按照既定方案拔除右側(cè)上頜第一磨牙，為了防止愈合過程中的牙合創(chuàng)傷，將右側(cè)下頜對應第一磨牙同期拔除，然后采用定制式驅(qū)動器將定制的純鈦螺旋型種植體(圖1)即刻植入拔牙后留下的遠中腭根窩洞中。術(shù)后用軟質(zhì)飲食和無菌水喂養(yǎng)小鼠4周，使種植體植入后進行骨結(jié)合。植入種植體后4周，即刻處死空白組小鼠(即結(jié)扎處理前)；對照組小鼠不做結(jié)扎處理，飼喂2周后處死；模型組小鼠采用結(jié)扎誘導法建立實驗性種植體周圍炎模型，將5-0絲線牢固地環(huán)種植體的齦下頸部纏繞2圈，腭側(cè)打結(jié)，飼喂2周后處死。

圖1 定制式種植體示意圖Fig.1 Schematic diagram of a custom implant

1.3 標本處理 上述3組小鼠分別處死，獲取上頜骨，去除皮膚和肌肉，并在手術(shù)放大鏡下切取種植體腭側(cè)的牙齦組織， -80℃條件下儲存，用于基因表達分析；將剩余頜骨組織儲存于75%酒精中，以備Micro-CT掃描使用。

1.4 牙齦組織形態(tài)學觀察 使用手術(shù)放大鏡在肉眼情況下觀察種植體周圍牙齦組織的顏色、形態(tài)、質(zhì)地和滲出情況，評估牙齦炎癥表現(xiàn)。

1.5 采用Micro-CT掃描法測量種植體周圍骨高度和骨密度 采用Micro-CT掃描系統(tǒng)掃描小鼠上頜骨。將樣品在旋轉(zhuǎn)臺上暴露于X射線下，在70 kVp、200 mA電流和10 μm各向同性體素分辨率的操作電壓下進行測量，曝光時間為300 ms，并且每個視圖平均5幀。使用Mimics Research 20.0軟件進行種植體周圍骨質(zhì)的定量三維測量和影像的收集，種植體周圍骨高度(Bone height)是通過測量種植體尖端和附著在種植體近端、遠端、頰側(cè)、腭側(cè)的邊緣骨的最大冠狀位置之間的距離來確定的，單位為 μm。在每個樣本的種植體周圍選擇相同的感興趣體積(volume of interest,VOI)，其被定義為種植體周圍直徑為1.0 mm、高度為1.7 mm的圓柱體，使用Scanco micro-CTμ100 Evaluation Program v6.6軟件分析VOI內(nèi)骨密度，單位為mgHA/ccm。

A：Blank group； B：Control group； C：Model group.
圖2 各組小鼠種植體周圍牙齦組織大體形態(tài)表現(xiàn)
Fig.2 Gross morphology of gingival tissue around implants of mice in various groups

1.6 RT-PCR法檢測牙齦組織中TNF-αmRNA表達水平 將上述收集的腭側(cè)牙齦使用組織勻漿器在裂解緩沖液中勻漿，采用Trizol試劑提取總RNA，SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA。采用RT-PCR法測定種植體周圍牙齦組織中TNF-αmRNA表達水平。引物如下：TNF-α，forward 5′-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3′,reverse 5′-CTGATGAGAGGGAGGCCATT-3′， GAPDH，forward 5′-ATGGGTGTGAACCACG-

AGA-3′，reverse 5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′。GAPDH為內(nèi)參照基因。采用2-ΔΔCt法計算TNF-α mRNA表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠種植體周圍牙齦組織的大體形態(tài)學表現(xiàn) 在種植體植入愈合完全后、施用結(jié)扎之前，空白組小鼠種植體周圍牙齦未見明顯的炎癥征象；未結(jié)扎的對照組小鼠種植體周圍牙齦無肉眼可見的炎癥征象；結(jié)扎2周后，模型組小鼠種植體周圍牙齦組織可見明顯的發(fā)紅、水腫、質(zhì)地變軟和滲出。見圖2(插頁三)。通過顯微組織鑷手動檢查時，各組種植體仍然保持不動。

2.2 各組小鼠種植體周圍骨高度和骨密度 各組小鼠種植體周圍骨高度的三維和二維影像變化見圖3。模型組小鼠種植體周圍可看到明顯的牙槽骨丟失，而空白組和對照組小鼠種植體周圍牙槽骨無明顯變化。各組小鼠種植體周圍骨高度值見表1。與空白組比較，對照組小鼠種植體的近端、遠端、頰側(cè)和腭側(cè)骨高度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組小鼠種植體的近端、遠端、頰側(cè)和腭側(cè)骨高度明顯降低(P<0.01)。與空白組[(993.50±10.02)mg HA/ccm]比較，對照組小鼠種植體周圍牙槽骨骨密度[(1 034.00±44.05 mg HA/ccm] 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組小鼠種植體周圍牙槽骨骨密度[(964.60±6.59)mg HA/ccm]明顯降低(P<0.05)。

A：Blank group； B：Control group； C：Model group.圖3 各組小鼠種植體周圍頜骨的Micro-CT掃描結(jié)果Fig.3 Micro-CT scan results of upper jaw bone around implants of mice in various groups

2.3 各組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達水平 與空白組(1.060±0.090)比較，對照組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達水平(1.291±0.080)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達水平(3.013±0.580)明顯升高(P<0.01)。

3 討 論

牙種植體的植入是目前牙齒缺失患者極為重要的修復方法之一。而種植體周圍炎會導致種植體周圍骨質(zhì)的丟失甚至種植手術(shù)的失敗。先前已在犬[12]、非人類靈長類動物[13]和小型豬[14]中成功誘導了種植體周圍炎。與較大的動物不同，以小鼠作為動物模型成本更低，并且可以提供易于操作的多種可修飾基因缺陷，使得小鼠成為了理想的實驗動物模型，可以借此進一步深入探討種植體周圍炎發(fā)病機制中的細胞和炎癥因子變化。

本研究采用的即刻種植的手術(shù)方法是基于目前臨床上的主流趨勢而選擇的。近年來不翻瓣即刻種植在臨床上廣泛開展，其具有療程短、愈合快、保留軟組織能力佳和成功率高的特點[15]。研究[16]表明：

表1 各組小鼠種植體周圍骨高度Tab.1 Bone heights around implants of mice in various groups

*P<0.01 compared with control group.

延期種植和即刻種植對種植體周圍軟組織無明顯影響，即刻種植在永久修復3個月時的紅色美學效果要優(yōu)于延期種植。本研究采用的拔牙后即刻種植的方法無需翻瓣，手術(shù)使用定制的驅(qū)動器植入，該方法簡單微創(chuàng)，具有侵入性小和最小化出血的特點，最大程度地降低了因為手術(shù)操作過久或創(chuàng)傷過大導致的動物死亡問題，與以前的方法[2-3]相比更加具備科學性和適用性，值得推廣使用。

在本研究中，模型組小鼠牙齦組織有肉眼可見的炎癥征象，為排除這種炎癥僅是種植體周圍黏膜炎的可能，采用Micro-CT掃描種植體周圍的牙槽骨并分析骨高度，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠有明顯的種植體周圍骨質(zhì)破壞，與人類種植體周圍炎的定義基本相符，即病變已突破黏膜屏障累及骨組織造成骨缺損。本研究通過對比空白組和對照組小鼠的檢測結(jié)果，可以觀察到時間因素并未對種植體周圍炎起到誘導作用，但也可能是因為時間較短，若種植體長期暴露于小鼠口腔內(nèi)未得到良好的清潔，也可能會導致菌斑相關(guān)性炎癥和種植體周圍軟硬組織的破壞。因此，本研究的結(jié)扎干預可以在短期內(nèi)誘導炎癥發(fā)生，從而成功建立實驗性種植體周圍炎小鼠模型。

研究[17]表明：TNF-α水平升高可能與種植體周圍炎有關(guān)。TNF-α可通過激活細胞因子、趨化因子、細胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥過程[18]。研究[19]顯示：在慢性炎性骨疾病如牙周炎和類風濕關(guān)節(jié)炎中，TNF-α能夠直接誘導骨丟失，增加破骨細胞活性。本研究中，與對照組比較，模型組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA高表達，表明TNF-α也是重要的炎癥介體，促進了種植體周圍炎的進展，介導與種植體周圍炎相關(guān)的骨質(zhì)破壞。研究[20-21]表明：TNF-α可以通過上調(diào)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的基質(zhì)細胞產(chǎn)生并增加破骨細胞前體對RANKL的反應性，間接增強破骨細胞的形成。因此，基于以上結(jié)果，TNF-α mRNA在模型小鼠牙齦組織中高表達可能對種植體周圍炎的發(fā)病具有促進作用。本研究結(jié)果為今后的種植體周圍炎治療提供了一個新的靶點。

綜上所述，本研究成功建立了實驗性種植體周圍炎小鼠模型，并驗證了TNF-α在實驗性種植體周圍炎模型小鼠牙齦組織中高表達。未來針對TNF-α的研究有望深入揭示種植體周圍炎的發(fā)病機制，為尋找其潛在的治療方法探索新的方向。