IL-6/STAT3通路介導(dǎo)lncRNA H19上調(diào)在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)病中的作用

鄧 穎，朱宇珍，吳科鋒，鄭學(xué)寶，葉 華

(1.廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東省天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023；2. 茂名市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 茂名525000；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 廣州 510006)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種主要累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，具有癌變的風(fēng)險。潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌(ulcerative colitis-associated colorectal cancer, CAC)是UC的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，占UC 患者死亡原因的10%～15%[1]，其發(fā)生與UC患者病程和炎癥程度有明顯關(guān)聯(lián)。其中白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)/ 信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)信號通路在UC發(fā)展為CAC的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，是連接炎癥與腫瘤的重要通路之一[2]。UC癌變過程中常伴隨著p53基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(APC)和原癌基因K-ras等多種基因變異，但目前尚無基因能有效預(yù)測CAC的發(fā)生。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類核苷酸長度大于200 nt、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。有研究[3-5]顯示：lncRNA參與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等過程，可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等多種水平上參與細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控。lncRNA H19(簡稱H19)同時也是一種母源性印跡基因，在胚胎發(fā)育期顯著高表達(dá)，出生后僅在心肌和骨骼肌中低表達(dá)[6]。H19的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌[7]、肝癌[8]、胃癌[9]和胰腺癌[10]等腫瘤有密切關(guān)聯(lián)。H19在不同腫瘤中扮演不同的角色，其中H19在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移[6,11]。目前關(guān)于H19在CAC中的表達(dá)情況、功能和作用機(jī)制的研究尚未見報道。本研究通過建立CAC小鼠模型，檢測H19和IL-6/STAT3通路相關(guān)因子的表達(dá)水平，探討其可能的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要試劑及儀器 氧化偶氮甲烷(AOM)購自美國Sigma公司，葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子質(zhì)量36 000～50 000)購自美國MP Bio公司，Trizol總RNA提取試劑盒、DEPC濃縮液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A和熒光定量PCR試劑盒RR420A 購自寶生物(大連)工程公司，兔抗小鼠IL-6、磷酸化STAT3(p-STAT3)、c-Myc和β-actin購自美國CST公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天生物科技研究所，小鼠隱血試劑盒購自南京建成生物工程研究所，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。組織包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，RM 2235組織切片機(jī)(德國LEICA公司)，核酸蛋白定量儀和MasterCycler Gradient PCR儀(德國Eppendorf公司)，ABI7500型定量PCR儀(美國ABI公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和垂直板電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 小鼠CAC模型的建立 22只小鼠隨機(jī)分為對照組(10只)和模型組(12只)。模型組小鼠予以生理鹽水配制的AOM溶液(12 mg·kg-1)腹腔注射1次，對照組則腹腔注射等量的生理鹽水；觀察1周后，模型組小鼠先予以蒸餾水配制的2% DSS溶液自由飲用5 d，再換普通潔凈水飲用16 d，21 d為1個循環(huán)，共4個循環(huán)；造模期間對照組小鼠一直飲用普通潔凈水，造模于第120天結(jié)束。

1.4 觀察方法 造模期間，每天觀察小鼠進(jìn)食量、精神狀態(tài)、活動情況和毛發(fā)亮澤度等，給予DSS前1 d及后1 d分別記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，按Cooper法進(jìn)行小鼠疾病活動度(DAI)評分。取材前小鼠禁食24 h，處死前摘眼球取血，ELISA法檢測血清中IL-6水平；小鼠處死后取盲腸至肛門段結(jié)腸，測量長度，并觀察結(jié)腸大體形態(tài)及計數(shù)腫瘤個數(shù)。最后，將模型組小鼠結(jié)腸腫瘤分為3部分，分別用于HE染色、qPCR法檢測和Western blotting法檢測；同時對照組小鼠取相應(yīng)結(jié)腸段行上述檢測。

1.5 HE染色觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn) 將新鮮切取的結(jié)腸組織迅速浸泡在10%甲醛溶液中固定48 h后脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，制作石蠟病理切片，脫蠟復(fù)水，蘇木素染3 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，伊紅染6～8 s，自來水沖洗后晾干封片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 ELISA法檢測小鼠血清中IL-6水平 將小鼠血液室溫靜置10 min后4℃、3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清，按ELISA試劑盒說明書操作，450 nm波長處測定吸光度(A)值。繪制ELISA標(biāo)椎曲線，計算小鼠血清中IL-6水平。

1.7 qPCR法檢測小鼠結(jié)腸組織中H19、let-7a、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑提取2組小鼠結(jié)腸組織的總RNA，按照兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，合成cDNA，qPCR擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸40 s，共40個循環(huán)。以上目的RNA引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計獲得(表1)，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.8 Western blotting法檢測小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3和c-Myc蛋白表達(dá)水平 按照蛋白提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白總量，配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，加入樣品，90 V恒壓濃縮30 min，再120 V恒壓分離60 min，繼而轉(zhuǎn)膜和封閉，加入一定比例稀釋的一抗，4℃孵育過夜； TBST洗膜3 次，二抗孵育60 min后繼續(xù) TBST 洗膜 3 次，化學(xué)發(fā)光后采集圖像，用Gel-Pro 軟件檢測各蛋白條帶的A值，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行半定量分析。目的蛋白表達(dá)水平=目的條帶A值/β-actin條帶A值。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Tab.1 Primer sequences of purpose genes and internal reference genes

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠一般情況 模型組小鼠在飲用DSS后的第3天出現(xiàn)稀便，第7 天均有不同程度的腹瀉和血便，撤去DSS后的1～2 d較嚴(yán)重，然后逐漸恢復(fù)；小鼠第2循環(huán)出現(xiàn)腸道癥狀的時間晚于第1循環(huán)，程度較輕；第3和4循環(huán)時腹瀉、便血等癥狀均較前一循環(huán)加重，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)雜亂暗淡、倦怠懶動、拱背、厭食和體質(zhì)量減輕，部分小鼠甚至出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象。造模期間，小鼠因嚴(yán)重便血、極度消瘦而死亡3只。對照組小鼠則精神狀態(tài)良好，毛發(fā)有光澤，活潑好動，大便成形。2組小鼠體質(zhì)量和DAI評分變化見圖1。

2.2 2組小鼠成瘤率和結(jié)腸長度 對照組小鼠結(jié)腸表面光滑，沿縱軸剖開，可見腸腔內(nèi)糞便成形，未見明顯充血水腫、潰瘍和腫物形成。模型組小鼠結(jié)腸外觀充血水腫、短縮變形及腸腔變窄，可見隆起型或潰瘍型腫物形成，表面不規(guī)則，多位于近肛門側(cè)(圖2，見插頁一)。模型組小鼠成瘤率為100%，腫瘤數(shù)目為(2.78 ± 1.30)個，結(jié)腸長度為(5.62 ± 0.48)cm，較對照組小鼠結(jié)腸長度[(6.27± 0.32) cm]明顯縮短(P<0.01)。

圖1 2組小鼠體質(zhì)量(A)和DAI評分(B)Fig.1 Body weights(A) and DAI scores(B) of mice in two groups

A:Control group; B:Model group.
圖2 2組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)表現(xiàn)
Fig.2 Gross morphology of colon of mice in two groups

2.3 2組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列規(guī)則，隱窩結(jié)構(gòu)整齊，可見杯狀細(xì)胞，無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠結(jié)腸組織腺體結(jié)構(gòu)基本消失，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核增大深染，細(xì)胞極性喪失，排列紊亂，大多呈彌漫性排列，局部伴有炎癥細(xì)胞浸潤，組織呈高級上皮內(nèi)瘤變，多數(shù)局限于黏膜上皮或固有層，極個別侵襲至黏膜肌層。見圖3(插頁一)。

A:Control group; B:Model group.
圖3 2組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE，×200)
Fig.3 Pathomorphology of colon tissue of mice in two groups (HE，×200)

2.4 2組小鼠血清中IL-6水平 與對照組 [(28.00±4.10)μg·L-1]比較，模型組小鼠血清中IL-6水平[(48.00±8.00)μg·L-1]明顯升高(P<0.01)。

2.5 2組小鼠結(jié)腸組織中H19、let-7a、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表達(dá)水平 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中H19、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，let-7a mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.6 2組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3和c-Myc蛋白表達(dá)水平 與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3和c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見表3和圖4。

表2 2組小鼠結(jié)腸組織中H19、let-7a、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of H19, IL-6, STAT3 and c-Myc mRNA in colon tissue of mice in two groups

*P<0.01vscontrol group.

表3 2組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3和c-Myc蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of p-STAT3 and c-Myc proteins in colon tissue of mice in various groups

*P<0.01vscontrol group.

Lane 1: Control group; Lane 2: Model group.圖4 2組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3和c-Myc蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of p-STAT3 and c-Myc proteins in colon tissue of mice in two groups

3 討 論

本研究采用AOM/DSS小鼠模型來模擬UC癌變的過程。AOM/DSS模型[12]是目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘導(dǎo)CAC模型，可以呈現(xiàn)UC活動期與恢復(fù)期交替以及慢性非特異性腸炎向腸癌轉(zhuǎn)變的過程，與CAC發(fā)病模式“正常腸黏膜 → 急性炎癥 → 慢性炎癥 → 不典型增生 → 上皮內(nèi)瘤變 → 腺癌”相似，炎癥反應(yīng)在該過程中起重要的推動作用。已有研究[13]表明：約15%腫瘤是由感染和非可控炎癥引起的。UC癌變可能與反復(fù)的炎癥刺激導(dǎo)致腸黏膜微環(huán)境中的炎癥因子呈持續(xù)活躍狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)原癌基因過度激活，抑癌基因表達(dá)降低有關(guān)。

可溶性IL-6是鏈接炎癥與腫瘤的關(guān)鍵因子，主要由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌，可通過IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-6 mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高，血清中IL-6水平也明顯升高。高表達(dá)的IL-6可誘導(dǎo)胞漿中STAT3持續(xù)磷酸化而激活，p-STAT3可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核并結(jié)合靶基因，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。STAT3的靶基因有B淋巴細(xì)胞瘤因子2、B細(xì)胞淋巴瘤因子2 XL 、 細(xì)胞周期蛋白D1、c-Myc和血管內(nèi)皮生長因子等，主要參與細(xì)胞凋亡、增殖和血管形成等生物過程的調(diào)控[14-15]。p-STAT3具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中STAT3和c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高。c-Myc是原癌基因之一，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控，過度表達(dá)的c-Myc可導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，誘發(fā)癌變。

c-Myc同時可作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。一項有關(guān)肺癌的研究[16]顯示：c-Myc可與H19啟動子相結(jié)合，激活H19表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究顯示：模型組小鼠結(jié)腸組織H19 mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高，并且H19表達(dá)趨勢與c-Myc表達(dá)一致，提示H19在CAC中也可能受到c-Myc的正調(diào)控，UC發(fā)生癌變可能與H19過度表達(dá)有關(guān)。H19可通過多種作用方式參與腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育調(diào)控。研究[17]表明：H19在結(jié)直腸癌中主要通過上調(diào)其第1個外顯子編碼產(chǎn)物miR-675表達(dá)，使抑癌基因Rb表達(dá)下降，從而產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。另外，關(guān)于胰腺導(dǎo)管癌的研究[10]顯示：H19可以下調(diào)let-7表達(dá)，let-7對下游靶蛋白高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)的抑制作用減弱，導(dǎo)致HMGA2介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)增強(qiáng)，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率增加。

let-7是一種微小RNA(microRNA)，最早在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，是線蟲時序性發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，在哺乳動物中調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控。AKAO等[18]研究發(fā)現(xiàn)：let-7a-1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)均下降；當(dāng)過表達(dá)let-7a-1后，Ras和c-Myc蛋白表達(dá)水平均明顯下降，結(jié)腸癌細(xì)胞增殖受到抑制，提示let-7a在結(jié)直腸癌中具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的生物學(xué)功能。本研究結(jié)果顯示:模型組小鼠結(jié)腸組織中l(wèi)et-7a mRNA表達(dá)水平較對照組明顯降低，提示CAC小鼠的發(fā)病與let-7a低表達(dá)有關(guān)。基于let-7a表達(dá)趨勢與H19的相反，并且已有研究[19]表明：H19可直接干擾let-7a表達(dá)，推測CAC小鼠的發(fā)病與H19可能抑制let-7a表達(dá)有關(guān)。let-7a表達(dá)還受到“c-Myc-Lin28-let-7a-c-Myc”調(diào)控環(huán)路調(diào)節(jié)[20]，let-7a對c-Myc表達(dá)具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示:let-7a表達(dá)趨勢與c-Myc表達(dá)相反，提示在CAC發(fā)病過程中，let-7a有可能下調(diào)c-Myc的表達(dá)。

綜上所述，在CAC小鼠的發(fā)病過程中，活動性UC小鼠腸黏膜中可溶性IL-6過度表達(dá)，激活I(lǐng)L-6/STAT3通路后作用于下游靶基因c-Myc，c-Myc表達(dá)上調(diào)能激活H19表達(dá)，進(jìn)而抑制let-7a表達(dá)，let-7a對c-Myc表達(dá)的抑制作用減弱，導(dǎo)致原癌基因c-Myc過度表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)H19表達(dá)，降低let-7a表達(dá)，導(dǎo)致UC小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞無限增殖而發(fā)生癌變。因此，IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的原癌基因c-Myc、H19過度表達(dá)及抑癌基因let-7a表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖而誘發(fā)癌變，可能是CAC發(fā)病的分子機(jī)制之一。但在CAC發(fā)病過程中上述各因子之間的相互作用尚不明確，有待進(jìn)一步的實驗研究證實。