谷氨酰胺通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對新生大鼠高氧肺損傷的保護作用

王 葉，王 紅，張書劍，姬華祎，金正勇

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 延吉 133000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院兒科, 吉林 長春 130033)

隨著新生兒重癥監(jiān)護技術(shù)的提高，因補充氧引起氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生率逐年升高，因其遠(yuǎn)期預(yù)后差，嚴(yán)重影響患兒身心健康及生存質(zhì)量，逐漸受到國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。高氧肺損傷的機制復(fù)雜，尚不十分明確，目前國內(nèi)外研究認(rèn)為其與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等通路作用有密切關(guān)聯(lián)[1-2],其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)信號通路相關(guān)蛋白凋亡在高氧肺損傷中發(fā)揮重要作用[3-4]，國內(nèi)外很多研究[5-6]已證實谷氨酰胺(glutamine,GLN)對肺損傷具有保護作用，但其具體機制尚未完全清楚,且目前有關(guān)GLN對新生大鼠高氧肺損傷的保護作用及其機制的研究很少。本研究通過構(gòu)建新生大鼠高氧肺損傷模型，以模擬臨床上新生兒長期暴露于高氧致肺損傷，探討CLN對高氧肺損傷模型大鼠肺組織中ERS信號通路相關(guān)標(biāo)志性蛋白超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、半胱氨酸蛋白酶 12(Caspase-12)、生長停滯和DNA損害基因153 (growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD153)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulation protein 78,GRP78)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)表達(dá)的影響及作用機制，為臨床應(yīng)用GLN防治新生兒高氧肺損傷提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器 足月新生Wistar大鼠90只(雌雄不限)和哺乳母鼠，由延邊大學(xué)動物科提供，動物許可證號：SYXK(吉)2007-0011。GLN(美國Sigma-Aldrich公司)，GADD153、GRP78、Caspase-12、Bax和Bcl-2抗體(圣克魯斯上海生物技術(shù)有限公司)，SOD和MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。液氮機由延吉市畜牧局冷凍站提供，TGL-16低速離心機購自湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TD 2000彩色病理圖像分析儀購自北京天地百年科技有限責(zé)任公司。

1.2 高氧肺損傷模型制備 足月新生Wistar大鼠90只隨機分為對照組、高氧組和高氧+GLN組，每組30只。對照組大鼠在同一室內(nèi)呼吸常壓空氣，將高氧組和高氧+GLN組大鼠放在材質(zhì)相同的玻璃箱內(nèi)，每天用數(shù)字式測氧儀測氧濃度3次，使玻璃箱內(nèi)氧濃度維持在85%以上，玻璃箱內(nèi)氧濃度保持一致，在玻璃箱底部加入鈉石灰吸收二氧化碳，使室內(nèi)及玻璃箱內(nèi)溫度穩(wěn)定在25℃～26℃，濕度維持在60%～70%，每天開箱5 min，記錄2組大鼠一般情況，更換墊料，及時加水和飼料。同時對照組和高氧+GLN組母鼠交換，防止母鼠因高氧影響新生鼠喂養(yǎng)及護理導(dǎo)致的實驗誤差。從實驗第1天開始，定時向高氧+GLN組新生大鼠腹腔內(nèi)注射GLN(0.75 g·kg-1·d-1)，同時將等劑量生理鹽水注射于另外2組新生大鼠相同部位。

1.3 標(biāo)本采集和處理 各組大鼠分別于第3、7和14天采用10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉，剪開胸腔，完全暴露出心和肺，取右側(cè)肺組織置于-70℃冰箱內(nèi)保存，用于檢測肺組織中SOD活性，MDA水平，GADD153、GRP78、Caspase-12、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平；留取部分左側(cè)肺組織計算干濕質(zhì)量比，部分左側(cè)肺組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，然后進(jìn)行脫水、透明、包埋和切片，行HE染色,觀察大鼠肺組織中肺泡大小、間隔及炎性細(xì)胞浸潤等形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 大鼠肺組織含水量測定 留取部分左側(cè)肺組織，并用醫(yī)用棉清潔后立即稱量，記為濕質(zhì)量(W)。放入60℃烤箱內(nèi)每天稱量，持續(xù)2 d未見質(zhì)量變化，記為肺組織干質(zhì)量(D)。用Elliot公式計算肺組織含水量：[(W-D)/W]×100%，記錄結(jié)果。

1.5 大鼠肺組織中SOD活性和MDA水平檢測 取適量左側(cè)肺組織稱質(zhì)量，制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r·min-1離心10 min后取上清液待測。采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法測定肺組織中SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法測定肺組織中MDA水平，按照SOD和MDA檢測試劑盒說明書操作，并記錄數(shù)值, 單位分別為mg·g-1和μmol·g-1。

1.6 采用蛋白免疫印跡(Western blotting)法檢測大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平 取保存的肺組織于液氮低溫下磨碎，加入含有裂解緩沖液和苯甲基磺酰氟的EP管中，充分裂解離心后，按步驟操作，包括蛋白提取、蛋白濃度測定、SDS-PAGE凝膠配制、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和抗體反應(yīng)。X光片曝光后顯影、定影和晾干。圖像經(jīng)掃描后用Image J軟件計算目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間各組大鼠體質(zhì)量 實驗第3、7和14天，與同時間對照組比較，高氧組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同時間各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of rats in various groups at different time

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hyperoxia group.

2.2 不同時間各組大鼠肺組織含水量 實驗第3、7和14天，與對照組比較，高氧組大鼠肺組織含水量明顯升高(P<0.05)，且高氧暴露時間越長，肺組織含水量升高越明顯；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠肺組織含水量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 不同時間各組大鼠肺組織含水量Tab.2 Water contents in lung tissue of rats in various groups at different time

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hyperoxia group.

2.3 各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn) 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見肺泡水腫，肺泡大小及肺泡間隔大致一致，無炎性細(xì)胞浸潤；高氧組大鼠肺組織中支氣管及肺泡上皮細(xì)胞腫脹，肺泡管腔增大，間質(zhì)細(xì)胞水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤及纖維滲出；與同時間高氧組比較，高氧 + GLN組大鼠肺組織中肺泡損傷程度、炎性滲出及纖維組織增生程度均減輕，介于高氧組和對照組之間。見圖1(插頁一)。

A-C:Control group;D-F:Hyperoxia group;G-I:Hyperoxia+GLN group;A,D,G:3 d;B,E,H:7 d;C,F,I:14 d.
圖1 不同時間各組大鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE,×200)
Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of rats in various groups at different time(HE,×200)

2.4 不同時間各組大鼠肺組織中SOD活性和MDA水平 實驗第3、7和14天，與對照組比較，高氧組大鼠肺組織中SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠肺組織中SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 不同時間各組大鼠肺組織中SOD活性和MDA水平Tab.3 Activities of SOD and levels of MDA in lung tissue of rats in various groups at different time

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hyperoxia group.

2.5 不同時間各組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平 與同時間對照組比較，高氧組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153和Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平和Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)。見圖2和表4～6。

3 討 論

GLN是一種必需氨基酸，作為人體內(nèi)最豐富的游離氨基酸，其作用包括提供最廣泛的能量、提高免疫系統(tǒng)功能及參與DNA合成、細(xì)胞增殖和組織修復(fù)等[7-8]。本研究通過構(gòu)建新生大鼠高氧肺損傷模型模擬人類新生兒支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)典型病理生理改變，結(jié)果顯示：第3、7和14天時，高氧組大鼠肺組織HE染色均出現(xiàn)典型高氧肺損傷病理生理表現(xiàn)，與甘燕子等[9]研究一致，表明本實驗高氧肺損傷模型構(gòu)建成功。

Lane 1-3:Control group;Lane 4-6:Hyperoxia group;Lane 7-9:Hyperoxia+GLN group; Lane 1,4,7:3 d;Lane 2,5,8:7 d;Lane 3,6,9:14 d.
圖2 不同時間各組大鼠肺組織中ERS信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.2 Electrophoregram of ERS signal pathway-related proteins in lung tissue of rats in various groups at different time

表4 實驗第3天各組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值Tab.4 Expression levels of Caspase-12, GRP78, GADD153，Bcl-2, and Bax proteins and ratios of Bcl-2/Bax in lung tissue of rats in various groups on 3rd day of experiment

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hyperoxia group.

表5 實驗第7天各組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值Tab.5 Expression levels of Caspase-12, GRP78, GADD153, Bcl-2, and Bax proteins and ratios of Bcl-2/Bax in lung tissue of rats in various groups on 7th day of experiment

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with hyperoxia group.

表6 實驗第14天各組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值Tab.6 Expression levels of Caspase-12, GRP78, GADD153, Bcl-2, and Bax proteins and ratios of Bcl-2/Bax in lung tissue of rats in various groups on 14th day of experiment

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with hyperoxia group.

本研究中高氧組和高氧+GLN組大鼠體質(zhì)量較對照組均降低，高氧組大鼠體質(zhì)量降低更明顯，表明高氧環(huán)境可導(dǎo)致新生鼠及幼鼠生長發(fā)育落后，生長延遲，與國內(nèi)相關(guān)學(xué)者研究一致[10]；而GLN治療組新生大鼠較同時間高氧大鼠組體質(zhì)量增加，表明GLN對高氧導(dǎo)致的新生大鼠體質(zhì)量下降有一定的緩解作用。高濃度氧可引起肺內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞損傷，破壞肺泡上皮細(xì)胞完整性，進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫[11]。本研究結(jié)果顯示：高氧組和高氧+GLN組大鼠均有不同程度肺水腫，高氧+GLN組大鼠肺水腫程度減輕，表明GLN對高氧導(dǎo)致的肺部水腫具有緩解作用。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，高氧組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)存在一定程度的破壞，在高氧中暴露時間越長，損傷程度越重；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠肺泡損傷程度和炎性滲出等均減輕。本研究結(jié)果表明：高濃度氧可導(dǎo)致大鼠肺損傷，出現(xiàn)炎癥性改變，與部分研究[12-14]結(jié)果相一致，而GLN對高氧導(dǎo)致的肺損傷可起到一定程度的保護作用。

ERS時，可產(chǎn)生MDA，過量自由基生成MDA等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及新的自由基，并可鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大損害作用，引起細(xì)胞代謝功能障礙和死亡[15]。SOD可通過減少自由基的產(chǎn)生，保護機體所受損傷[16]。本研究結(jié)果顯示：在高氧中長時間暴露后，新生大鼠肺組織中SOD活性明顯降低同時MDA水平明顯升高，原因可能與高氧后肺組織產(chǎn)生多量氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)過度消耗有關(guān)，表明高氧改變了新生鼠氧化防御，與有關(guān)學(xué)者研究結(jié)果相一致[17]；而加入GLN治療后大鼠肺組織中SOD活性升高，MDA水平降低，表明GLN對細(xì)胞凋亡起到干預(yù)作用,與李松濤等[18]研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗證GLN在保護高氧肺損傷、阻止細(xì)胞凋亡方面起重要作用。

GRP78是ERS的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)有關(guān)，ERS時機體通過增加GRP78的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)[19]。C/EBP同源蛋白(CHOP)/GADD153是ERS介導(dǎo)的凋亡通路之一，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡重要的轉(zhuǎn)錄因子。CADD153在生理狀態(tài)下表達(dá)水平較低，ERS時以CADD153的表達(dá)水平增加為標(biāo)志[20]。 Caspase-12只在ERS通路中被激活, 是ERS的標(biāo)志性分子[21]。ERS時Caspase-12被激活，Caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)被啟動后促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-12表達(dá)水平增加可作為ESR的特異性標(biāo)志。JNK介導(dǎo)的凋亡可通過線粒體途徑上調(diào)促凋亡蛋白Bax，或經(jīng)由死亡受體蛋白發(fā)生作用，或者可通過降低Bcl-2的表達(dá)直接促凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，高氧組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低；與高氧組比較，高氧+GLN組大鼠肺組織中Caspase-12、GRP78、GADD153和Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高。本研究結(jié)果表明：高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡啟動了ERS，通過大鼠體質(zhì)量變化、肺組織含水量、肺組織病理變化以及肺組織中SOD活性和MDA水平變化證實GLN對高氧誘導(dǎo)的肺損傷具有保護作用；同時通過檢測ERS相關(guān)的標(biāo)志性蛋白表達(dá)的結(jié)果，證明GLN可通過ERS途徑對高氧誘導(dǎo)的大鼠肺組織損傷起到保護作用,與有關(guān)研究[23-24]結(jié)果相一致。

綜上所述，腹腔注射GLN可減輕高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺水腫及肺泡結(jié)構(gòu)損傷破壞，其對細(xì)胞凋亡的抑制作用是通過調(diào)節(jié)SOD活性和MDA水平及影響ERS相關(guān)標(biāo)志性分子的表達(dá)而實現(xiàn)的。GLN通過ERS途徑對高氧誘導(dǎo)的新生大鼠肺損傷發(fā)揮保護作用。