油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因分子標(biāo)記的研究進(jìn)展

尹明智 胡 燕 張 瑜 楊勝潔 楊 露

（遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，貴州遵義 563006）

油菜CMS系統(tǒng)中應(yīng)用最廣是pol CMS和ogu CMS。其中，ogu CMS僅在歐洲應(yīng)用較多，我國及世界大部分地區(qū)主要是利用pol CMS，并選育了一大批優(yōu)良雜交種應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來，隨著育種技術(shù)水平的提高，陸續(xù)出現(xiàn)了一些其他類型的CMS系統(tǒng)，如Nsa CMS[1]、hau_CMS[2]等。由于CMS育性能被恢復(fù)基因恢復(fù)，因此選育恢復(fù)系實(shí)現(xiàn)“三系配套”是油菜雜交育種的重要內(nèi)容。常規(guī)育種中選育恢復(fù)系的有效方法是通過雜交轉(zhuǎn)育、成對測交鑒定來選擇含恢復(fù)基因的種質(zhì)資源，然而這種方法的工作量大，且周期長。分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）可以實(shí)現(xiàn)在早期世代對恢復(fù)基因進(jìn)行鑒定，可以有效加速恢復(fù)材料的選育過程、縮短育種周期，達(dá)到提高育種效率的目的[3]。因此，油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的分子標(biāo)記研究在近年來深受重視。本文對pol CMS、ogu CMS以及其他CMS系統(tǒng)的恢復(fù)基因分子標(biāo)記研究進(jìn)行了綜述，以期為進(jìn)一步開發(fā)恢復(fù)基因的分子標(biāo)記、建立恢復(fù)基因MAS技術(shù)體系提供參考。

1 pol CMS恢復(fù)基因的分子標(biāo)記研究

自pol CMS被發(fā)現(xiàn)以來，科研人員就著手選育其恢復(fù)系，對其恢復(fù)基因進(jìn)行了大量的研究。研究表明pol CMS的恢復(fù)基因由1-2對主效基因控制[4-5]。Jean等鑒定出與恢復(fù)基因緊密連鎖的10個RFLP標(biāo)記以及1個RAPD標(biāo)記，其中1個RFLP標(biāo)記CRFl與Rfp1和Rfp2完全連鎖[6-7]。王俊霞篩選到與Rfp連鎖的兩個RAPD標(biāo)記S1019．720與S1036．810，并成功轉(zhuǎn)化為 SCAR 標(biāo)記（SCS1O19．720和SCS1O36．745），還找到了分布于Rfp兩側(cè)的3個RFLP標(biāo)記，其中1個標(biāo)記與恢復(fù)基因的遺傳圖距是18．0cM[8]，此外還篩選到2個RAPD標(biāo)記AH19690和AI16830。這兩個RAPD標(biāo)記位于pol CMS恢復(fù)基因的同側(cè)，遺傳距離分別為5．9cM和13．6cM，有利于進(jìn)一步利用分子標(biāo)記選育pol CMS的新恢復(fù)系[9]。

劉平武等篩選了RAPD標(biāo)記引物648條、SSR標(biāo)記引物472對和AFLP標(biāo)記引物256對，通過分析獲得了2個連鎖標(biāo)記，其中分子標(biāo)記E7P16230與目標(biāo)基因的遺傳距離為4．3cM，標(biāo)記S1-500與目標(biāo)基因的遺傳距離為10．8 cM[10]。采用BSA法，趙振卿篩選了AFLP標(biāo)記引物3072對，找到了與Rfp基因連鎖的標(biāo)記24對，最近的標(biāo)記距Rfp基因位點(diǎn)為0．4cM，并將兩個距離較近的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化成了SCAR標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記SCAPO612ST與恢復(fù)基因位點(diǎn)連鎖最緊密，且適用性更為廣泛，可用于MAS育種[11]。Zeng FQ等通過構(gòu)建BC1群體，從1024個AFLP標(biāo)記中篩選到13個與Rfp基因位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記，并將其中5個AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并將Rfp基因定位在N18連鎖群上[12]。蔡強(qiáng)篩選了AFLP標(biāo)記引物3840對，獲得與Rfp基因緊密連鎖的標(biāo)記15個，其中與恢復(fù)基因遺傳圖距最近的僅為0．65 cM[13]。Yun Li等[14]通過實(shí)驗(yàn)研究獲得了一個與 Rfp 基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記KBrDP1，其與Rfp基因的遺傳圖距僅為0．2cM。Zhi Liu[15]等利用公共數(shù)據(jù)庫開發(fā)了86個SSR標(biāo)記和115個SCAR標(biāo)記，結(jié)果有13個標(biāo)記與Rfp基因緊密連鎖。這些研究加快了對Rfp基因的克隆以及優(yōu)良恢復(fù)系的選育。

2 Ogu CMS恢復(fù)基因的分子標(biāo)記研究

Delourme R等篩選了RAPD引物138個，從中獲得了4個與Rfo基因完全連鎖的標(biāo)記，通過研究成功將這4個標(biāo)記轉(zhuǎn)化成了更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，并將轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中帶有恢復(fù)基因的蘿卜染色體片段定位在第15連鎖群上[16-17]。Mats Hanse 等通過分析RAPD引物960條，其中有14條與Rfo基因連鎖，有4個RAPD標(biāo)記可用于恢復(fù)基因的MAS育種[18]。Maruyama S等采用BSA法獲得了與Rfo基因連鎖的RAPD標(biāo)記7個，這些標(biāo)記分布在Rfo基因的兩側(cè)，其中OPHll410與Rfo基因遺傳圖距是1．2cM，是離目標(biāo)基因遺傳距離最近的一個標(biāo)記[19]。后來他們通過構(gòu)建F2群體進(jìn)行分析，篩選了AFLP標(biāo)記32個，結(jié)果獲得了與目標(biāo)基因連鎖的AFLP標(biāo)記1個，并將它轉(zhuǎn)化成了STS標(biāo)記，其與Rfo基因遺傳距離為1．2cM[20]。汪志偉通過構(gòu)建F2群體，采用BSA法篩選了100條RAPD引物發(fā)現(xiàn)標(biāo)記OPC06-1900與Rfo基因連鎖，遺傳圖距為11．6cM，然后通過進(jìn)一步研究將標(biāo)記OPC06-1900成功轉(zhuǎn)換，獲得了兩個顯性的SCAR標(biāo)記SCC06-1894和SCC06-415，與Rfo基因的遺傳圖距為8．0cM[21]。通過構(gòu)建BC1群體，鄭晨光采用BSA法篩選了500個RAPD標(biāo)記引物，其中標(biāo)記S1344和S88與Rfo基因連鎖，其遺傳圖距分別為4．2cM和6．9cM，這兩個標(biāo)記之間的遺傳圖距為9．1cM，并且分布在Rfo基因的兩側(cè)，可用于對Rfo基因的MAS育種[22]。這些分子標(biāo)記的獲得能夠促進(jìn)ogu CMS恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育，提高了ogu CMS的應(yīng)用價值及范圍。

3 其他CMS恢復(fù)基因的分子標(biāo)記研究

Heike Trendelkamp等對11個AFLP標(biāo)記進(jìn)行了分析，獲得了一個18．3cM的Tour CMS連鎖圖譜[23]。Janeja H S等對64個AFLP標(biāo)記進(jìn)行了研究，篩選出2個與恢復(fù)基因連鎖的標(biāo)記，其中EACC/MCTT105與RFt1的遺傳圖距為18．1cM，與RFt2的遺傳圖距為33．2cM，另一標(biāo)記EAAG/MCTC80位 于 RFt1另一側(cè)，與 之 相 距亦是 18．1cM，為利用MAS技術(shù)研究Tour CMS恢復(fù)系打下了基礎(chǔ)[24]。程計(jì)華等通過構(gòu)建F2分離群體，獲得了一個與Nsa CMS恢復(fù)基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記，與恢復(fù)基因的遺傳距離在2．0cM左右[3]。接著，又獲得了一個AFLP標(biāo)記EM107，其與恢復(fù)基因間的交換率在6．7%左右[25]。孫盼盼對180對AFLP標(biāo)記引物進(jìn)行分析，從中找到多態(tài)性AFLP標(biāo)記17對；對94條RAPD標(biāo)記引物進(jìn)行分析，從中找到多態(tài)性RAPD標(biāo)記10個，對96對SSR標(biāo)記引物進(jìn)行分析，從中找到多態(tài)性SSR標(biāo)記2對；對170對SRAP標(biāo)記引物進(jìn)行分析，從中找到多態(tài)性標(biāo)記引物30對，然后利用F2群體單株驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)了4個SRAP標(biāo)記與Nsa CMS恢復(fù)基因連鎖[26]。Hu Qiong等根據(jù)PPR基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物進(jìn)行分析，開發(fā)了一個與Nsa CMS恢復(fù)基因緊密連鎖的標(biāo)記[27]。這些分子標(biāo)記的開發(fā)加快了新胞質(zhì)雄性不育系在油菜育種中的應(yīng)用，對于油菜雜交育種的可持續(xù)性發(fā)展十分有利。

4 展望

隨著生物技術(shù)以及測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的分子標(biāo)記被開發(fā)和應(yīng)用。油菜是主要油料作物，選育強(qiáng)優(yōu)勢雜交種和提高油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)一直是育種家的育種目標(biāo)。常規(guī)的油菜CMS育種需要大量的測交，選育恢復(fù)系，耗時較長，工作量較大，而對恢復(fù)基因進(jìn)行分子標(biāo)記研究可以獲得與恢復(fù)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記較穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，能對基因型進(jìn)行直接篩選。利用這些連鎖的分析標(biāo)記可以快而準(zhǔn)確地篩選具有恢復(fù)基因的材料，從而選育出恢復(fù)系，可有效縮短育種進(jìn)程。尤其對于恢復(fù)源較窄的異源胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的選育是非常實(shí)用的，可以幫助育種家在大量的種質(zhì)資源的中快而準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)恢復(fù)源材料，提高不育系的應(yīng)用價值。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)雖然有很多優(yōu)勢，但是它的準(zhǔn)確性依賴于實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段、實(shí)驗(yàn)材料等因素。因此，為了獲得精準(zhǔn)的結(jié)果，建議將常規(guī)育種手段與分子育種技術(shù)相結(jié)合，相互驗(yàn)證。通過連鎖標(biāo)記發(fā)現(xiàn)恢復(fù)源材料后，還是需要做測交試驗(yàn)，最終通過觀察測交后確認(rèn)篩選的材料是否真的具有較強(qiáng)的恢復(fù)能力以及配合力。相信隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、油菜基因組測序的完成以及常規(guī)育種技術(shù)的提高，各類分子標(biāo)記的開發(fā)越來越方便，其檢測手段也將逐步改善，與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合更成熟，將會更有效地用于油菜的雜交育種，從而加快推進(jìn)油菜育種的進(jìn)程。