膝康止痛方對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎鎮(zhèn)痛作用研究

姚 旭，王清華，王 野

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110847）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA），是一種以進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退化，軟骨下骨改變，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，滑膜組織炎癥和增生，韌帶退變和半月板以及關(guān)節(jié)囊肥大為病理特征的膝關(guān)節(jié)疾病，是常見的骨關(guān)節(jié)炎，是骨科康復(fù)的常見病[1-5]。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎由力學(xué)和生物學(xué)因素引發(fā)的關(guān)節(jié)軟骨組織異常，以退行性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鱗6]。其主要癥狀是膝關(guān)節(jié)疼痛，僵硬，可伴有腫脹，關(guān)節(jié)活動(dòng)欠利等。本研究是將我科自制經(jīng)驗(yàn)方膝康止痛方進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)研究，通過觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥 膝康止痛方方藥組成：獨(dú)活10 g，羌活10 g，桑寄生15 g，牛膝15 g，海風(fēng)藤10 g，雞血藤15 g，川芎6 g，延胡索10 g，甘草5 g。臨床服用一天半劑量，折合成大鼠等效劑量為6.6 g·kg-1·d-1，小鼠的等效劑量約為10 g·kg-1·d-1。實(shí)驗(yàn)用藥制備：全部藥品購(gòu)買于遼寧省中醫(yī)院大藥房。稱取藥物后，按重量：體積為1:8 的比例加水，煮沸后煎煮2 h，倒出藥液后，再重新加水煮沸后煎煮2 h，將2 次的藥液混勻后濃縮成終濃度為1.5 g·L-1的儲(chǔ)備液冷藏備用。

1.2 主要試劑 IL-1β ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限提供；TNF-α ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限提供；Masson 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；醋酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)（分析純）批號(hào)：F20061101。

1.3 主要儀器 RM-2245 石蠟切片機(jī)（LEICA），ZKMIAX 顯微鏡（Olympus），Epoch 酶標(biāo)儀（BioTek），冷CCD 凝膠成像系統(tǒng)（Image Quant 350），CMIAS 病理顯微鏡分析處理系統(tǒng)，eppendorf 微量移液器，1 mL和5 mL 醫(yī)用注射器等。

1.4 動(dòng)物 wistar 大鼠，SPF 級(jí)，雄性，180～220 g；KM小鼠，SPF 級(jí)，18～22 g，雌雄各半，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證書：SCXK（遼）2015-0001。

1.5 方法

1.5.1 小鼠鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 小鼠正常適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組。CMC 對(duì)照組：給予CMC 混懸液，阿司匹林對(duì)照組：阿司匹林，0.2 g·kg-1·d-1，膝康止痛方低劑量組：10 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高劑量組：30 g·kg-1·d-1，12 只/組，雌雄各半。按上述各組藥物及劑量分別灌胃給藥連續(xù)3 d，2 次/d。第4 日給藥1 次30 min 后，各組小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只。分別觀察記錄各組小鼠：1）扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間；2）給予醋酸后20 min 內(nèi)扭體反應(yīng)發(fā)生次數(shù)及抑制率。

1.5.2 大鼠膝關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分組。1）正常對(duì)照組：蒸餾水1 mL·100 g-1·d-1；2）模型組：1 mL·100 g-1·d-1；膝康止痛方低劑量組：6.6 g·kg-1·d-1，膝康止痛方高劑量組：20 g·kg-1·d-1。造模方法：仰臥位固定于木板上，剪去所要注射的膝關(guān)節(jié)腔周邊1 cm 區(qū)域的腿毛，絡(luò)合碘消毒。右膝髕旁內(nèi)側(cè)切口，逐層打開關(guān)節(jié)腔，將髕骨向外側(cè)推使之脫位，膝關(guān)節(jié)處于最大屈曲狀態(tài)，暴露關(guān)節(jié)腔，剪斷前交叉韌帶。正常對(duì)照組打開關(guān)節(jié)腔后不剪斷前交叉韌帶。各治療組連續(xù)給予上述藥物8周，灌胃給藥，2 次/d，1 mL·100 g-1·d-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，全部動(dòng)物麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心后保留血清，存于-80℃冰箱中保存。病理學(xué)檢測(cè)，標(biāo)本切取后立即投入10%甲醛固定48 h，后入10%甲酸溶液浸泡，連續(xù)脫鈣12 d，至組織完全脫鈣。蒸餾水浸泡，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片6 μm，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 病理染色方法 HE 染色：Bounin 固定液固定48 h，經(jīng)30%甲酸脫鈣 48 h 后，切片經(jīng)過二甲苯梯度脫蠟，蘇木精浸染5 min，水洗，再入伊紅浸染5 min，水洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。Masson 染色：全部標(biāo)本按常規(guī)石蠟切片程序處理，7 um 厚度切片，切片移至水洗，入 PH6.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸漬 30 min（37℃），移入濃度為 0.5%的透明質(zhì)酸酶消化 6 h，經(jīng)水洗后，切片入 2 mol/L 氯化鈣液浸洗 48 h 再經(jīng)水洗后做Masson 染色，Weigert 蘇木素A 和Weigert 蘇木素B 等比混合，染色10 min，蒸餾水洗1 min，Masson 復(fù)合染色液染色15 min，蒸餾水稍沖洗，1% 磷鉬酸液處理5 min，苯胺藍(lán)染色液復(fù)染5 min，1% 冰醋酸水處理1 min，脫水透明封片。

1.5.4 甲苯胺藍(lán)染色：甲苯胺藍(lán)染液30 min，自來(lái)水沖洗，冰醋酸分化至胞核清晰，再次自來(lái)水沖洗，風(fēng)干后二甲苯透明，中性樹膠封固。病理顯微鏡拍照，每張切片選取3 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 膝康止痛方小鼠鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 膝康止痛方通過預(yù)防性灌胃給藥3 天后，0.6%醋酸溶液復(fù)制小鼠疼痛模型，觀察膝康止痛方對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶媒對(duì)照CMC 組小鼠20 min 出現(xiàn)明顯的扭體反應(yīng)，膝康止痛方兩個(gè)劑量組的扭體次數(shù)明顯減少，與CMC組比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)（扭體法）扭體次數(shù)（，n=12）

表1 小鼠鎮(zhèn)痛試驗(yàn)（扭體法）扭體次數(shù)（，n=12）

注：與CMC 組比較，## P＜0.01

2.2 膝康止痛方治療大鼠膝關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

2.2.1 大體病理觀察 末次給藥后24 h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部麻醉處死，分離膝關(guān)節(jié)，暴露關(guān)節(jié)面，光鏡下觀察膝關(guān)節(jié)表面完整度和損壞程度。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠的膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面光整，色澤如常，未見明顯的損傷；模型組出現(xiàn)關(guān)節(jié)面粗糙，缺損或潰瘍形成，且色澤灰暗，有的甚至出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的剝脫；中藥治療組損傷均有所緩解。

2.2.2 組織病理學(xué)觀察結(jié)果 大鼠膝關(guān)節(jié)經(jīng)過脫鈣，切片等過程后，采用了HE，masson 和甲苯胺藍(lán)染色觀察關(guān)節(jié)的損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠的軟骨表面光滑完整，結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞排列，染色均勻，可見完整的潮線存在，未見病理系損傷（見圖1A）。模型組關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)缺損或缺失，軟骨明顯變薄，結(jié)構(gòu)不清，染色不均，軟骨細(xì)胞排列紊亂，總數(shù)減少，潮線扭曲不規(guī)則（見圖1B）。膝康止痛方給藥組軟骨的損傷得到不同程度的緩解，高劑量組效果更好（見圖1C，圖1D）。

2.2.3 Masson染色結(jié)果 正常組膠原纖維和軟骨呈藍(lán)色，胞漿纖維素呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色，四層結(jié)構(gòu)很清晰可以分辨，可以分清潮線；軟骨細(xì)胞染色均勻（圖2A），模型組軟骨組織表明受損，形狀不規(guī)則、缺陷，藍(lán)色的軟骨膠原減少，紅色的纖維成分增多，分布不均（見圖2B）治療組可逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞的損傷（見圖2C，圖2D）。

2.2.4 甲苯胺藍(lán)染色 軟骨、成骨細(xì)胞染色成紫藍(lán)色。正常對(duì)照組軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞染成藍(lán)色，其他染成紅色。模型組軟骨結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。治療組損傷均有不同程度的緩解。

圖1 關(guān)節(jié)軟骨的HE 染色結(jié)果（HE，×100）

圖2 關(guān)節(jié)軟骨的Masson 染色結(jié)果（Masson，×100）

圖3 關(guān)節(jié)軟骨的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果（甲苯胺藍(lán)，×100）

2.2.5 病理積分統(tǒng)計(jì)結(jié)果 參考Markin[7]骨關(guān)節(jié)病組織評(píng)分方法，通過不同的染色方法進(jìn)行病理評(píng)分。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的軟骨組織表現(xiàn)出明顯的病理學(xué)損傷，病理學(xué)積分值均顯著增高；與模型組相比，中藥治療組的病理?yè)p傷均有明顯改善，病理學(xué)積分值均明顯降低。見圖4。

2.3 大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠麻醉后進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，取血清后，檢測(cè)IL-1β、TNF-α 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組的IL-1β 和TNF-α 均明顯增高，P＜0.01；與模型組相比，膝康止痛方組的IL-1β和TNF-α明顯降低，P＜0.05和P＜0.01，見表2。

圖4 關(guān)節(jié)炎的病理積分結(jié)果

表2 膝康止痛方對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影響（，n=8）

表2 膝康止痛方對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β 和TNF-含量的影響（，n=8）

注：與對(duì)照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎，中醫(yī)大致屬于“骨痹”“痹證”“膝痹”等范疇[8-9]。病因病機(jī)多因肝腎虧虛，勞傷日久，氣血不足，筋骨失養(yǎng)，風(fēng)寒濕邪趁虛而入，氣血凝滯，經(jīng)脈不通，不通則痛，發(fā)為本病。肝腎虧虛，是多種疾病發(fā)病的基本病機(jī)，補(bǔ)益肝腎，是治療相關(guān)疾病的基本法則[10]。本病可從本虛標(biāo)實(shí)的角度辨證施治。本實(shí)驗(yàn)用藥膝康止痛方是由獨(dú)活寄生湯、蠲痹湯和我院止痛散加減化裁而成，方中獨(dú)活、羌活、海風(fēng)藤以祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛，主祛筋骨間的風(fēng)寒濕邪。桑寄生、牛膝、補(bǔ)骨脂，補(bǔ)肝腎，壯筋骨，雞血藤、當(dāng)歸補(bǔ)血舒筋，通絡(luò)止痛，川芎、延胡索行氣通絡(luò)止痛，甘草益氣調(diào)和。方中陰陽(yáng)氣血調(diào)和，通脈止痛并重。諸藥共行補(bǔ)腎強(qiáng)筋，祛風(fēng)除濕，化瘀止痛之用。

膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與年齡，體質(zhì)量指數(shù)和身體健康狀況關(guān)系密切。早期疼痛和晚期的致畸是影響患者生活質(zhì)量的重要因素[11]。對(duì)于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，緩解骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)疼痛仍然是治療的焦點(diǎn)。目前臨床上用藥應(yīng)用的止痛藥物主要為非甾體類抗炎藥等[12]，但是療效的同時(shí)產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一些新的潛在治療關(guān)節(jié)炎的藥物，但還未在臨床應(yīng)用[13]。

中醫(yī)藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎可通過多種途徑緩解疼痛癥狀，延緩KOA 的病理進(jìn)程[14-16]。膝康止痛方為我科的經(jīng)驗(yàn)方劑，經(jīng)過多年對(duì)KOA 患者應(yīng)用，能明顯緩解疼痛癥狀，提高生活質(zhì)量，但其機(jī)制不清。為了觀察膝康止痛方的鎮(zhèn)痛作用，我們采用0.6%醋酸小鼠腹腔注射方法復(fù)制經(jīng)典的疼痛模型觀察膝康止痛方鎮(zhèn)痛作用，從客觀的量化角度評(píng)價(jià)該方的鎮(zhèn)痛效果。指標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，膝康止痛方能顯著抑制醋酸所致的小鼠扭體反應(yīng)，提示其具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

炎性細(xì)胞因子在膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中的作用日益受到人們的關(guān)注。TNF-α 和IL-1β 等細(xì)胞因子能夠抑制軟骨細(xì)胞的合成，促進(jìn)其分解。炎癥發(fā)生時(shí)TNF-α和IL-1β 受到NF-κB 和急性反應(yīng)蛋白（AP）的調(diào)節(jié)，以自分泌的方式參與炎癥反應(yīng)，并能促進(jìn)其他細(xì)胞因子如NO，PGE2，IL-6，MMP1，MMP9 和MMP13 的合成與分泌[17-18]。

巨噬細(xì)胞存在于正常膝關(guān)節(jié)，非病理狀態(tài)下處于休眠狀態(tài)。但是炎癥存在時(shí)被激活，分泌的多種致炎細(xì)胞因子。其中TNF-α 作用最強(qiáng)，亦能協(xié)同其他細(xì)胞介素（如IL-1β、IL-6 等）作用，在膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展中起到十分重要作用[19]。IL-1β 存在膝骨關(guān)節(jié)炎中主要IL-1 亞型，有多種細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等）分泌，與軟骨細(xì)胞上的受體結(jié)合后，一方面促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，另外促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）的合成與分泌，增加軟骨細(xì)胞的降解，提高破骨細(xì)胞的活性，加重膝關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)[20］。中藥復(fù)方以其多藥味組合為特點(diǎn)，可以降低炎癥細(xì)胞因子[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中的TNF-α和IL-1β 含量明顯增多，灌胃膝康止痛方后顯著降低大鼠血清中二者的含量，高劑量組作用更明顯。

綜上所述膝康止痛方具有明顯的止痛作用，能緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程，且該作用與降低TNF-α 和IL-1β 有關(guān)。