子午流注針法對心理應(yīng)激大鼠HPA軸中樞調(diào)控的影響

王毅,王雯,ANGGARAENI KOMANG ROSA TRI,王儒蒙,張艾嘉,董燁卿,吳吉霞,許英萍,胡智海

·動物實驗·

子午流注針法對心理應(yīng)激大鼠HPA軸中樞調(diào)控的影響

王毅1,王雯1,ANGGARAENI KOMANG ROSA TRI2,王儒蒙1,張艾嘉1,董燁卿1,吳吉霞3,許英萍3,胡智海1

(1.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200082;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201210;3.上海市虹口區(qū)歐陽路街道衛(wèi)生服務(wù)中心,上海 200081)

觀察子午流注針法對心理應(yīng)激大鼠HPA軸中樞調(diào)控中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血清皮質(zhì)醇(CORT)及免疫因子白細(xì)胞介素1(IL-1)的影響,探討子午流注針法治療心理應(yīng)激的機制。52只Wistar大鼠隨機分為子午流注開穴組、針刺對照組、造模組、正常組,每組13只。采用旁觀電擊實驗建立心理應(yīng)激模型。子午流注開穴組以養(yǎng)子時刻開穴法定時開穴治療,針刺對照組針刺取百會穴。放射免疫法分別檢測血清CORT和ACTH含量、下丘腦中CRH含量、垂體中ACTH含量、腎上腺中CORT含量,免疫組化法、RT-PCR法分別檢測下丘腦、垂體中IL-1及其mRNA表達(dá)水平。與正常組比較,造模組大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘腦中CRH含量、垂體中ACTH含量、腎上腺中CORT含量顯著升高(＜0.01),下丘腦、垂體中IL-1及其mRNA表達(dá)水平顯著升高(＜0.01);與造模組比較,子午流注開穴組大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘腦中CRH含量、垂體中ACTH含量、腎上腺中CORT含量顯著降低(＜0.01),下丘腦、垂體中IL-1及其mRNA表達(dá)水平顯著降低(＜0.01);與針刺對照組比較,子午流注開穴組大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘腦中CRH含量、垂體中ACTH含量、腎上腺中CORT含量明顯降低(＜0.05),下丘腦、垂體中IL-1及其mRNA表達(dá)水平明顯降低(＜0.05)。子午流注開穴針法可以調(diào)控心理應(yīng)激大鼠CRH、ACTH、CORT的異常分泌,促進(jìn)處于異常狀態(tài)的HPA軸向正常狀態(tài)恢復(fù),其作用機制可能與下調(diào)IL-1 mRNA,減少誘發(fā)ACTH的分泌,傳遞信號參與大腦中樞調(diào)控有關(guān),從而改善機體出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)。

子午流注針法;心理應(yīng)激;HPA軸;中樞調(diào)控;白細(xì)胞介素1;大鼠

隨著社會環(huán)境和生活方式的改變,人們更易產(chǎn)生抑郁、焦慮、緊張等應(yīng)激心理,導(dǎo)致抑郁癥、焦慮癥、睡眠障礙等疾病發(fā)生,對社會和家庭都造成嚴(yán)重的不良影響。因此近年來心理應(yīng)激因素參與疾病的發(fā)生、發(fā)展的臨床及機制研究得到廣泛重視。

研究表明,心理應(yīng)激觸發(fā)機體產(chǎn)生的生理學(xué)效應(yīng)包括急性自主神經(jīng)功能不全、神經(jīng)內(nèi)分泌激活、血流動力學(xué)改變和引發(fā)炎癥反應(yīng)過程[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸在心理應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展和康復(fù)過程中扮演重要角色,應(yīng)激反應(yīng)的中樞效應(yīng)主要發(fā)生在HPA軸,而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、血清皮質(zhì)醇(CORT)及免疫因子白細(xì)胞介素1(IL-1)被認(rèn)為在HPA軸中樞調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[3]。目前心理應(yīng)激以心理治療為主,再輔以對癥的藥物,但是心理治療費用昂貴,療效也不穩(wěn)定,藥物不良反應(yīng)多[4]。針灸治療心理應(yīng)激具有效率高、安全性好及療效穩(wěn)定的特點,臨床中已得到驗證[5-8]。尤其是子午流注針法在臨床治療應(yīng)激相關(guān)疾病如抑郁癥、焦慮癥、睡眠障礙都有較好療效[9-14]。其治療機制與調(diào)控HPA軸功能,減少相關(guān)激素(如CRH、ACTH、CORT)的分泌有關(guān)。本實驗建立心理應(yīng)激大鼠模型,采用子午流注針法為治療方法,觀察其行為表現(xiàn)、曠場試驗評分,CRH、ACTH、CORT含量,IL-1及其mRNA表達(dá)的影響,探討子午流注針法在治療心理應(yīng)激中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SPF級Wistar大鼠69只,體質(zhì)量162.6～203.1 g,上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號[SYXK(滬)2014-0008]。所有大鼠同一室內(nèi)飼養(yǎng)(溫度23～25℃,相對濕度40%～50%,環(huán)境安靜,自由攝食、飲水)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

自制交流箱,電動勻漿機(PRO200,上海FLUKO公司),移液槍(P2、P10、P20、P100、P200、P1000,吉爾森P型移液器公司),旋渦振蕩器(K30,青浦瀘西儀器廠),低溫冷凍離心機(TG-16M,上海盧湘儀離心機儀器有限公司),Real-time檢測儀(ABI-7300,美國ABI公司),恒溫烘箱(DHG-9023A,上海恒一科學(xué)儀器有限公司),石蠟切片機(SQ2125,徠克公司),正置顯微鏡(CX41,OLYMPUS公司)。

1.3 主要試劑

水合氯醛(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),IHC免疫組化試劑盒(JRDUN公司,中國),IL-1b兔多克隆抗體(Abcam公司,英國),二抗(Abcam公司,英國,羊抗兔),Trizol Reagent(Invitrogen公司,美國),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(aKaRa公司,日本),SYBGreen PCR試劑盒(Thermo公司,美國),Rat CRH ELISA Kit(JRDUN公司,中國),COAT放免測定試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所,中國),ACTH放免測定試劑盒(中國北京北方生物技術(shù)研究所),30%H2O2(上海國藥集團(tuán)),DAB濃縮型試劑盒(上海長島生物技術(shù)有限公司),蘇木素(BASO)。

1.4 分組與模型制備

全部大鼠中的17只作為應(yīng)激源大鼠,其余52只采用二次隨機法先分為兩組,13只設(shè)為正常組,另外39只進(jìn)行造模,造模成功后再隨機分為子午流注開穴組、針刺對照組、造模組,每組13只。

參照賈克然提供的方法[15]對大鼠進(jìn)行造模,在交流箱(42 cm×42 cm×22 cm)中進(jìn)行,該箱參照Ogawa和Kuwabara設(shè)計的交流箱[16]基礎(chǔ)上改進(jìn)。具體方法為在交流箱下層放入應(yīng)激源大鼠,上層放入造模大鼠,下層底部的銅絲組成連接電源,給應(yīng)激源大鼠足部間斷電擊,使其感受痛苦;上層造模大鼠透過透明有孔玻璃板感受應(yīng)激源大鼠發(fā)出的聲音、氣味等刺激。造模大鼠每天上午9:00—12:00進(jìn)行應(yīng)激造模,每次30 min,持續(xù)2周。其間觀察造模大鼠行為表現(xiàn)、曠場試驗評分,用以評判造模成功與否,行為表現(xiàn)不明顯,水平得分、垂直得分未顯著下降者剔除實驗。行為評定采用盲法,三位觀察者觀察錄像評分,一致性大于0.95。

應(yīng)激源大鼠僅用于產(chǎn)生刺激,不進(jìn)行其他實驗處理。正常組大鼠在相同的時間段放入交流箱各小室相同時間,但不進(jìn)行應(yīng)激。

1.5 干預(yù)方法

取陽輔、陽谷、解溪、陽溪、昆侖、支溝、百會。參照《實驗針灸學(xué)》“常用的大鼠針灸穴位及圖譜”[17],并結(jié)合解剖學(xué)方法及擬人對照法進(jìn)行大鼠穴位定位。陽輔,小腿下1/4折點處腓骨頭與外踝連線上;陽谷,橈腕關(guān)節(jié)背外側(cè),尺骨遠(yuǎn)端與尺腕骨之間凹陷中;解溪,踝關(guān)節(jié)背側(cè)中部兩筋之間;陽溪,腕橫紋之橈側(cè)凹陷處;昆侖,踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方,外踝高點與跟結(jié)節(jié)之間凹陷中;支溝,前肢外側(cè)距腕關(guān)節(jié)4 mm,尺、橈骨間;百會,頂骨正中。

子午流注開穴組:將大鼠仰臥位束縛于大鼠固定架上,以養(yǎng)子時刻開穴法定穴,按日時干支推算出甲日戊辰時開陽輔穴,乙日庚辰時開陽谷穴,丙日壬辰時開解溪穴,丁日甲辰時開陽溪穴,戊日丙辰時開昆侖穴,己日戊辰時開支溝穴,庚日庚辰時開陽谷穴,辛日壬辰時開解溪穴,壬時甲辰時開陽溪穴,癸日丙辰時開昆侖穴,消毒后直刺大鼠雙側(cè)穴位,選用0.18 mm×13 mm一次性針灸針,針刺深度3～5 mm,捻轉(zhuǎn)行針后留針20 min。每日1次,連續(xù)治療21 d。

針刺對照組:與子午流注開穴組同時開始治療,取百會,平刺進(jìn)針,針刺深度5 mm,捻轉(zhuǎn)行針后留針20 min。每日1次,連續(xù)治療21 d。

造模組和正常組束縛20 min不針刺。每日1次,連續(xù)干預(yù)21 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)測試

曠場測試(open field test, OFT),測試敞箱(80 cm×80 cm×40 cm),將底面平分為30個方格。實驗前60 min將待測大鼠放入測試間以適應(yīng)環(huán)境。實驗時將大鼠放置在敞箱正中央,觀察并記錄3 min內(nèi)大鼠的水平運動格數(shù)和垂直豎立次數(shù),計算水平和垂直得分?jǐn)?shù)總和,并分組記錄。

1.6.2 下丘腦中CRH含量測定

治療結(jié)束后第二天腹腔注射水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉大鼠,腹主動脈取血10 mL,斷頭后置于冰盤快速剝離下丘腦、垂體以及腎上腺,迅速置于液氮冷凍,稍后移至﹣80℃超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱量大鼠下丘腦組織,按質(zhì)量體積1:9加入生理鹽水研磨勻漿,3000 r/min離心后取上清液,嚴(yán)格按照CRH的ELISA試劑盒說明測定下丘腦組織中CRH的含量。在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6.3 放射免疫法測定血清ACTH和CORT、垂體ACTH、腎上腺COAT含量

取血樣2 mL,注入含10%EDTA二鈉30mL的試管中,混勻4℃,3000 r/min離心10 min,分離血漿。分別取垂體、腎上腺入勻漿管,按質(zhì)量體積1:9加入生理鹽水勻漿,3000 r/min離心10 min,棄上清,﹣20℃保存。分別按ACTH、CORT放免測定試劑盒說明書測定各血清和組織中ACTH、CORT的含量。

1.6.4 免疫組化方法檢測下丘腦、垂體中IL-1含量

取﹣80℃保存的大鼠下丘腦、垂體組織置于4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片?？酒竺撓炛了?微波修復(fù)抗原。3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化,濕盒孵育,滴加一抗,4℃孵育過夜。二抗孵育,DAB染色,蘇木素復(fù)染,二甲苯中透明,中性樹膠封片。通過顯微鏡拍照,采集分析樣本相關(guān)部位,計算陽性面積。

1.6.5 RT-PCR方法檢測下丘腦、垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)

IL-1上游引物5'-ATCTCACAGCAGCATCTC-3',下游引物5'-TAGCAGGTCGTCATCATC-3'(189 bps);Gapdh內(nèi)參上游引物5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3',下游引物5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'(181 bps)。取下丘腦或垂體組織(約100 mg),按照Trizol說明書提取總RNA,在紫外分光光度儀上測定A260/A280比值,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后核對擴(kuò)增動力學(xué)曲線,以GAPDH為內(nèi)參,通過2﹣△△ct法計算下丘腦、垂體IL-1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,方差齊時選擇法;不滿足正態(tài)分布計量資料選擇秩和檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為表現(xiàn)、曠場實驗得分

造模組大鼠初次放入交流箱內(nèi),探索欲強,前爪直立,鼻嗅四壁。造模后期,受電擊大鼠驚跳、尖叫的影響,造模組大鼠身體蜷縮,微閉雙眼,處于驚恐狀態(tài)。造模后,造模組大鼠和應(yīng)激源大鼠排便便次、便量、氣味和形狀較正常組有明顯變化,較造模前和電擊前也有明顯變化,便次增多、便量增多、氣味臭穢、大便不成型。治療期間,子午流注開穴組大鼠和針刺對照組大鼠的便次、便量、氣味、形狀均顯著改善。造模后,造模組、針刺對照組和子午流注開穴組大鼠的曠場實驗行為測定結(jié)果顯示,水平得分和垂直得分低于正常組(＜0.01)。詳見表1。

表1 大鼠曠場實驗行為測定結(jié)果 (±s,分)

注:與正常組比較1)＜0.01

2.2 各組大鼠下丘腦中CRH含量的比較

與正常組比較,造模組大鼠下丘腦中CRH含量顯著升高(＜0.01);與造模組比較,子午流注開穴組大鼠下丘腦中CRH含量顯著降低(＜0.01),針刺對照組大鼠下丘腦中CRH含量有所下降(＜0.05);與針刺對照組比較,子午流注開穴組大鼠下丘腦中CRH含量降低(＜0.05)。結(jié)果提示,在應(yīng)激心理模型造模成功后,下丘腦中CRH含量明顯升高,而針刺可降低CRH,以子午流注開穴更為明顯。詳見圖1。

注:與正常組比較1)P＜0.01;與造模組比較2)P＜0.05,3)P＜0.01;與針刺對照組比較4)P＜0.05

2.3 各組大鼠血清、垂體中ACTH含量的比較

與正常組比較,造模組大鼠血清和垂體中ACTH含量顯著升高(＜0.01);與造模組比較,子午流注開穴組大鼠血清和垂體中ACTH含量顯著降低(＜0.01),針刺對照組大鼠血清和垂體中ACTH含量有所下降(＜0.05);與針刺對照組比較,子午流注開穴組大鼠血清和垂體中ACTH含量降低(＜0.05)。結(jié)果提示,在應(yīng)急心理模型造模成功后,血清與垂體中ACTH含量明顯升高,而針刺可降低ACTH,以子午流注開穴更為明顯。詳見圖2。

2.4 各組大鼠血清和腎上腺中CORT含量的比較

與正常組比較,造模組大鼠血清和腎上腺中CORT含量顯著升高(＜0.01);與造模組比較,子午流注開穴組大鼠血清和腎上腺中CORT含量顯著降低(＜0.01),針刺對照組大鼠血清和腎上腺中CORT含量有所下降(＜0.05);與針刺對照組比較,子午流注開穴組大鼠血清和腎上腺中CORT含量降低(＜0.05)。結(jié)果提示,在應(yīng)急心理模型造模成功后,血清與腎上腺中CORT含量明顯升高,而針刺可降低CORT,以子午流注開穴更為明顯。詳見圖3。

2.5 各組大鼠下丘腦、垂體中IL-1表達(dá)的比較

本實驗采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠下丘腦和垂體的神經(jīng)細(xì)胞,陽性顆粒主要分布于細(xì)胞膜表面,形成一薄層棕黃色顆粒包繞整個細(xì)胞。每張切片在中倍鏡下(10×20)選取5個不同的視野,用顯微圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 5.1)檢測,分析每張切片陽性細(xì)胞的陽性面積表達(dá)。

在正常組大鼠下丘腦和垂體出現(xiàn)IL-1抗體免疫陽性細(xì)胞,但陽性面積偏少。造模組大鼠下丘腦和垂體IL-1抗體免疫陽性細(xì)胞大量表達(dá),分布廣泛。子午流注開穴組與針刺對照組分別對照造模組,散在分布,顏色變淺,表達(dá)較低。

由表2可見,造模組陽性細(xì)胞表達(dá)增高,與正常組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01),說明造模后IL-1在下丘腦和垂體表達(dá)升高。子午流注開穴組與針刺對照組較造模組IL-1表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。在下丘腦IL-1表達(dá)上子午流注開穴組與針刺對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05);在垂體IL-1表達(dá)上子午流注開穴組與針刺對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。說明子午流注開穴、針刺穴位均能降低心理應(yīng)激大鼠下丘腦和垂體中IL-1抗體免疫陽性細(xì)胞的表達(dá),其改善心理應(yīng)激狀態(tài)可能與其促進(jìn)HPA軸功能的調(diào)節(jié)有關(guān),子午流注開穴的效果一定程度上更為明顯。詳見表2,圖4-5。

表2 各組大鼠下丘腦中IL-1積分光密度、垂體中IL-1陽性面積表達(dá)比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與造模組比較2)＜0.01;與針刺對照組比較3)＜0.05,4)＜0.01

2.6 各組大鼠下丘腦、垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)的比較

與正常組比較,造模組大鼠下丘腦和垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)顯著升高(＜0.01);與造模組比較,子午流注開穴組大鼠下丘腦和垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)顯著降低(＜0.01),針刺對照組大鼠下丘腦和垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)有所下降(＜0.05);與針刺對照組比較,子午流注開穴組大鼠下丘腦和垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)降低(＜0.05)。見表3,圖6。

表3 各組大鼠下丘腦和垂體組織中IL-1 mRNA表達(dá)比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與造模組比較2)＜0.05,3)＜0.01;與針刺對照組比較4)＜0.05

3 討論

心理應(yīng)激屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇,主要見于西醫(yī)學(xué)的抑郁癥、癔癥、焦慮癥及睡眠障礙等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其基本病機為氣機郁滯而致肝氣郁結(jié)、心失所養(yǎng)、臟腑陰陽氣血失調(diào)?！端貑枴れ`蘭秘典論》:“心者,君主之官也,神明出焉。”《靈樞·邪客》:“心者,五臟六腑之大主也,精神之所舍也。”張錫純認(rèn)為“心腦共主神明”,腦為髓海主元神,心為血脈主藏神,腦髓需心血不斷充養(yǎng),心神感知的神明活動需腦中元神統(tǒng)御,二者不可或缺[18]。其病位在心、腦,常累及諸臟。針灸有調(diào)心神、腦神、理氣解郁的作用。子午流注開穴針法以時間變化為依據(jù),根據(jù)氣血流注盛衰開闔的理論,運用陰陽、五行變化,天干地支所司,臟腑、經(jīng)脈所主,逐日按時開穴針刺;具有把握時間,按時取穴,協(xié)調(diào)人體與自然節(jié)律,維持氣血陰陽平衡,有通經(jīng)愈病的功效[19-20]。臨床上子午流注針法在治療應(yīng)激相關(guān)疾病如抑郁癥、焦慮癥、睡眠障礙都有較好療效[9-14]?，F(xiàn)代時間生物醫(yī)學(xué)研究表明,十二經(jīng)脈流注經(jīng)穴電位值均高于表里經(jīng)穴電位值,并呈現(xiàn)同步變化,相鄰的井、滎、輸、經(jīng)、合,各組五輸穴電位值有明顯的遞增趨勢,說明子午流注穴位開合確有其特異性及一定的物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。研究表明子午流注針法采用五輸穴調(diào)節(jié)經(jīng)氣、理氣開郁,可有效治療“郁證”,改善心理應(yīng)激狀態(tài)[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)針灸治療慢性心理應(yīng)激有其優(yōu)勢,子午流注開穴組治療后的各項檢測指標(biāo)優(yōu)于針刺對照組,說明治療慢性心理應(yīng)激,在辨證施治的基礎(chǔ)上,結(jié)合日、時節(jié)律的影響,可以得到更好的療效。

HPA軸是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫的樞紐,應(yīng)激反應(yīng)的中樞效應(yīng)主要發(fā)生在HPA軸,在心理應(yīng)激中起到重要作用[23]。心理應(yīng)激發(fā)生后,作用于大腦,改變腦的內(nèi)分泌功能,其中最重要的途徑是HPA軸被激活。下丘腦的室旁核(PVN)是HPA軸活動的直接控制部位,當(dāng)應(yīng)激信號沿中樞神經(jīng)達(dá)到PVN時,引起促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)分泌。CRH促使垂體前葉釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH),ACTH激活了腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞合成釋放以皮質(zhì)醇(CORT)為中心糖皮質(zhì)激素(GC),促使機體各組織發(fā)生應(yīng)激防御反應(yīng)造成機體免疫力下降[24]。腎上腺皮質(zhì)激素與情緒的關(guān)系至為密切,其中尤以糖皮質(zhì)激素中的皮質(zhì)醇、可的松的作用更為顯著[25-26]。機體長期受到應(yīng)激刺激則使HPA軸處于亢進(jìn)狀態(tài),CRH、ACTH、CORT這3種激素分泌增加[27],則可能是心理應(yīng)激發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。

細(xì)胞因子IL-1主要參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及機體代謝。IL-1由單核巨噬細(xì)胞等合成與分泌,應(yīng)激過程中IL-1可通過血液循環(huán)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的IL-1受體發(fā)生作用,激活第二級分子如NO等,再由它們調(diào)節(jié)下丘腦激素的合成和釋放,最終引發(fā)較強的應(yīng)激反應(yīng)[28]。IL-1在正常大腦中以低水平表達(dá),作為神經(jīng)功能和神經(jīng)元存活的調(diào)節(jié)劑[29],當(dāng)應(yīng)激或炎癥刺激誘發(fā)時,IL-1釋放量可顯著增加,導(dǎo)致持續(xù)炎癥引起免疫反應(yīng)。大量證據(jù)表明IL-1和其他細(xì)胞因子能傳遞信號到大腦,其對HPA軸的調(diào)節(jié)是多水平、多方位的[30]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)對外周變化的免疫反應(yīng)中,細(xì)胞因子是聯(lián)系神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物質(zhì),研究表明IL-1bmRNA是誘導(dǎo)慢性應(yīng)激向抑郁樣行為發(fā)展的關(guān)鍵介導(dǎo)因子[31]。HPA軸釋放的激素除糖皮質(zhì)激素外,CRH和ACTH也參與免疫調(diào)節(jié),應(yīng)激引起免疫系統(tǒng)功能變化,致使淋巴細(xì)胞被激活,釋放各種細(xì)胞因子,而后者又可反向作用于CNS,影響CNS的免疫調(diào)節(jié)作用,它們之間的作用是雙向的[32-33]。因此,細(xì)胞因子IL-1能激活HPA軸,誘導(dǎo)下丘腦合成和釋放CRH,誘導(dǎo)垂體合成和釋放ACTH,誘導(dǎo)腎上腺合成和釋放COAT,而血清CORT的增多反過來又可抑制IL-1的合成和分泌,可見IL-1扮演著重要的角色。

同時最新研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性ACTH水平,在晝夜節(jié)律中有所不同,早上達(dá)到頂峰,并在一天中下降,而由垂體前葉分泌的ACTH與下丘腦釋放的CRH和來自血液CORT呈負(fù)反饋的關(guān)系,其均有相似的節(jié)律變化規(guī)律[34-35]。因此本研究亦從HPA軸中樞控制、IL-1細(xì)胞因子、子午流注針法按時開穴等環(huán)節(jié)入手,觀察按時開穴針刺對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)變化的影響,來尋求針刺的最佳時機和最佳腧穴的選擇[36-37],探討按時開穴對HPA軸中各個環(huán)節(jié)的作用規(guī)律,證實HPA軸的中樞控制是子午流注針法發(fā)揮作用的機制。

本實驗證明子午流注開穴組改善心理應(yīng)激狀態(tài)優(yōu)于針刺對照組,且能夠顯著下調(diào)IL-1 mRNA的表達(dá),減少CRH、ACTH、CORT的異常分泌。同時發(fā)現(xiàn)與心理應(yīng)激造模組大鼠相比下丘腦和垂體IL-1表達(dá)明顯下降。由此可見,子午流注針法促進(jìn)HPA軸功能的調(diào)節(jié),改善應(yīng)激狀態(tài)的機制可能與降低心理應(yīng)激大鼠下丘腦和垂體中IL-1抗體免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)有關(guān),子午流注開穴的療效更優(yōu)于針刺穴位,這與以往研究一致[38]。

本實驗有如下不足,在本實驗造模期間,發(fā)現(xiàn)造模組大鼠和應(yīng)激源電擊組大鼠排便次數(shù)、便量、氣味和形狀較正常組有明顯變化。經(jīng)過治療,子午流注開穴組大鼠和針刺對照組大鼠的排便次數(shù)、便量、氣味、形狀均顯著改善,而造模組和應(yīng)激源電擊組大鼠未有改善,心理應(yīng)激與排便的變化是否有直接的關(guān)聯(lián)[39-41],在后期研究中,應(yīng)增加對心理應(yīng)激后排便變化的觀察,稀便率的計算,大便常規(guī)檢查,遠(yuǎn)端結(jié)腸病理組織學(xué)檢查以及相關(guān)腸道免疫因子、細(xì)胞因子及基因檢測,以明確二者之間的變化關(guān)系。

子午流注針法強調(diào)時間因素對針刺效應(yīng)的影響,重視針灸時間效應(yīng)規(guī)律性。但現(xiàn)代針灸臨床中出現(xiàn)了“重用電針、舍棄傳統(tǒng)針法”的跡象,子午流注針法幾近無應(yīng)用現(xiàn)狀,開展子午流注針法臨床與基礎(chǔ)研究,是目前中醫(yī)針灸學(xué)發(fā)展迫切需要解決的問題之一。因此本實驗設(shè)置針刺對照組,用以比較子午流注針法與常規(guī)針法在治療心理應(yīng)激中是否具有差異性,比較傳統(tǒng)的時間針法與常規(guī)取穴法的治療優(yōu)勢。心理應(yīng)激是一種慢性疾病,是很多精神類疾病的早期狀態(tài),本實驗也發(fā)現(xiàn)該疾病的發(fā)展符合一定時間節(jié)律的變化,可見治療有時間規(guī)律性的疾病應(yīng)用子午流注針法療效優(yōu)于其他針灸方法[42],也為針灸治療精神類疾病打下一定基礎(chǔ)。

綜上所述,子午流注開穴組對心理應(yīng)激的療效優(yōu)于針刺對照組,其作用機制可能與下調(diào)IL-1 mRNA,減少誘發(fā)ACTH的分泌,傳遞信號參與大腦中樞調(diào)控,促進(jìn)處于異常狀態(tài)的HPA軸恢復(fù)正常有關(guān),其按時開穴針刺的方法又符合中樞激素節(jié)律性分泌的規(guī)律,調(diào)節(jié)HPA軸的中樞調(diào)控水平,改善機體出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)。

[1] Milrad SF, Hall DL, Jutagir DR,. Depression, evening salivary cortisol and inflammation in chronic fatigue syndrome: A psychoneuroendocrinological struc- tural regression model[J]., 2018,131: 124-130.

[2] 王寅,王洪巨.慢性心理應(yīng)激大鼠模型的建立及評價研究進(jìn)展[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,35(2):206-208.

[3] 娜琴,程飚,陳阿梅.應(yīng)激動物模型構(gòu)建方法及效果評價的研究進(jìn)展[J].中國組織工程研究與康復(fù),2011,15 (11):2051-2054.

[4] 王瓏,張迪,田旭升,等.電針對慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬CA3區(qū)突觸可塑性的影響[J].中國針灸,2017,37(2): 162-168.

[5] Luo D, Ma R, Wu Y,. Mechanism underlying acupuncture-ameliorated depressive behaviors by enhancing glial glutamate transporter in chronic unpredictable mild stress (CUMS) rats[J]., 2017,23:3080-3087.

[6] Lu J, Shao RH, Jin SY,. Acupuncture amelio- rates inflammatory response in a chronic unpredictable stress rat model of depression[J]., 2017, 128:106-112.

[7] Liu M, Zhang S, Gai Y,. Changes in the inters- titial cells of cajal and immunity in chronic psychological stress rats and therapeutic effects of acupuncture at the Zusanli Point (ST36)[J]., 2016,2016:1935372.

[8] Duan DM, Dong X,Tu Y,. A microarray study of chronic unpredictable mild stress rat blood serum with electro-acupuncture intervention[J]., 2016, 627:160-167.

[9] 謝珊.子午流注擇時耳穴貼壓法在抑郁癥伴失眠患者中的應(yīng)用及效果評價[D].南京:南京中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[10] 胡偉峰.基于子午流注理論的刮痧療法治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的臨床療效評價[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué), 2015.

[11] 李琛瑛,王毅,羅云,等.子午流注針法相關(guān)文獻(xiàn)研究分析[J].吉林中醫(yī)藥,2018,38(4):451-454.

[12] 黃墩兵,谷詩濃,周凡萍,等.子午流注針法治療原發(fā)性失眠的Meta分析[J].康復(fù)學(xué)報,2018,28(1):60-66.

[13] 秦媛媛,李方遠(yuǎn),郎琰,等.子午流注理論在失眠治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].實用中醫(yī)藥雜志,2018,34(2): 267-269.

[14] 劉春蘭,許金森.近5年子午流注針法研究概況[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2015,27(12):1661-1664.

[15] 賈克然,郭剛,劉開云,等.單純心理應(yīng)激小鼠模型的建立及對行為、內(nèi)分泌免疫功能的影響[J].免疫學(xué)雜志, 2009,25(3):329-332.

[16] Turk MJ, Guevara-Pati?o JA, Rizzuto GA,. Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is prevented by regulatory T cells[J]., 2004,200(6):771-782.

[17] 余曙光,徐斌.實驗針灸學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012:269-272.

[18] 盧小葉,孫冰,文錢,等.針灸治療焦慮癥的選穴規(guī)律探討[J].上海針灸雜志,2018,37(4):474-479.

[19] 張雅萍.淺談子午流注與時間醫(yī)學(xué)[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,6(2):6-7.

[20] 鄧柏穎,張劍飛,羅敏然,等.子午流注原絡(luò)配穴法治療運動性損傷及對經(jīng)絡(luò)狀態(tài)的影響[J].中國針灸,2006, 26(10):707-709.

[21] 李光華,朱玲勤,劉紅梅,等.五輸穴生理電位值測定分析[J].遼寧中醫(yī)雜志,2003,30(5):397.

[22] 趙越,歐陽亞萍,趙樹明,等.基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)探討針灸治療抑郁癥的腧穴配伍規(guī)律[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2018,34(1):176-178.

[23] 劉萍.電針對失眠大鼠焦慮抑郁情緒及交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的影響研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[24] 呂允濤.應(yīng)激的研究進(jìn)展及動物模型的建立[J].新農(nóng)業(yè),2014,(23):31-32.

[25] 姚弘,魏大能,蔡定均,等.針刺對慢性情緒應(yīng)激焦慮大鼠腎上腺ANP、CNP及血漿CORT水平的影響[J].中國針灸,2016,36(2):169-174.

[26] Koelsch S, Boehlig A, Hohenadel M,. The impact of acute stress on hormones and cytokines, and how their recovery is affected by musicevoked positive mood[J]., 2016,6:23008.

[27] 嚴(yán)燦,吳麗麗,徐志偉,等.不同治法方藥對慢性心理應(yīng)激大鼠下丘腦CRH mRNA表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2004,20(10):1164-1166.

[28] 李潔,彭麗,王楊天,等.五味子及復(fù)方中藥對實驗性慢性心理應(yīng)激下水上漂浮并高強度運動大鼠IL-1、IL-2、IL-6影響的研究[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,18 (1):14-16.

[29] Tonelli LH, Postolache TT. Tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, interleukin-6 and major histocompatibility complex molecules in the normal brain and after peripheral immune challenge[J]., 2005,27(7):679-684.

[30] 魏惠芬.針灸對不同應(yīng)激源所致免疫失調(diào)模型大鼠行為學(xué)及相關(guān)因子影響的實驗研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2010.

[31] Lu J, Shao RH, Hu L,. Potential antiinflammatory effects of acupuncture in a chronic stress model of depression in rats[J]., 2016,618:31-38.

[32] 孟宏.電針對慢性應(yīng)激疲勞證候模型大鼠神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2003.

[33] Badowska-Szalewska E, Ludkiewicz B, Spodnik JH,. The influence of mild stressors on neurons containing in- terleukin-1bin the central (CeA) and medial (MeA) amygdala in the ageing process of rats[J].(), 2015,75(3):279-292.

[34] Choi KW, Na EJ, Fava M,. Increased adrenocortico- tropic hormone (ACTH) levels predict severity of depression after six months of follow-up in outpatients with major depressive disorder[J]., 2018, 270:246-252.

[35] Becking K, Spijker AT, Hoencamp E,. Distur- bances in Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis and Immunological Activity Differentiating between Unipolar and Bipolar Depressive Episodes[J]., 2015,10(7):e0133898.

[36] 曹大明,路玫.按時取穴法中時辰概念之本意[J].中國針灸,2006,26(8):578-580.

[37] 陳日.子午納支針法運用于胃經(jīng)的fMRI研究[J].中國針灸,2015,35(12):1258-1262.

[38] 管遵惠,易榮,葉建,等.子午流注開穴對中風(fēng)病人心肌缺血影響的研究[J].中國針灸,2005,25(11):823- 824.

[39] 趙迎盼,唐旭東,卞兆祥,等.IBS-D肝郁脾虛型病證癥結(jié)合大鼠模型的建立與評價的初步研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,33(11):1507-1513.

[40] Nassar NN, Schaalan MF, Zaki HF,. Octreotide ameliorates gastric lesions in chronically mild stressed rats[J]., 2011,17(9):1135-1142.

[41] Zhou J, Li S, Wang Y,. Inhibitory Effects and Mechanisms of Electroacupuncture via Chronically Implanted Electrodes on Stress-Induced Gastric Hyper- sensitivity in Rats With Neonatal Treatment of Iodoace- tamide[J]., 2017,20(8):767-773.

[42] 馬文彬,劉旭光,覃勇,等.辰時麥粒灸對RA模型大鼠炎性因子IL-6晝夜節(jié)律的影響[J].中國針灸, 2016,36(4):396-401.

Effect ofNeedling Method on the Central Regulation of HPA Axis in Psychological Stress Rat Models

1,1,2,-1,-1,-1,-3,-3,-1.

1.-,200082,; 2.,201210,; 3.,200081,

To observe the effect of(midnight-noon ebb-flow) needling method on the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in central regulation of corticotropin-releasing hormone (CRH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), serum cortisol (CORT) and immunologic factor interleukin (IL)-1 in psychological stress rats, and to discuss the mechanism ofneedling method in treating psychological stress.Fifty-two Wistar rats were randomized into aacupoint-opening group, an acupuncture control group, a model group and a normal group, with 13 rats in each group. The psychological stress model was developed by witnessing electric shock experiment. Theacupoint-opening group was intervened following the acupoint-opening rule of nourishing the generation inand the acupuncture control group was treated by acupuncture at Baihui (GV20). The contents of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and the content of CORT in adrenal gland were detected using radioimmunoassay; the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body were determined using immunohistochemistry and RT-PCR, respectively.Compared with the normal group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland increased significantly in the model group (＜0.01), and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also increased significantly (＜0.01). Compared with the model group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland decreased significantly in theacupoint-opening group (＜0.01) and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also decreased significantly (＜0.01). Compared with the acupuncture control group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland decreased significantly in theacupoint-opening group (＜0.05) and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also decreased significantly (＜0.05).acupoint-opening acupuncture can regulate the secretion of CRH, ACTH and CORT in psychological stress rat models and promote the recovery of the HPA function. The mechanism is possibly associated with the down-regulation of IL-1 mRNA, reduction of the ACTH production and inhibition of the signal transduction to the central system.

needling method; Psychological stress; HPA axis; Central regulation; IL-1; Rat

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2020.01.0075

1005-0957(2020)01-0075-09

2019-06-18

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會項目(2014659);上海市虹口區(qū)“國醫(yī)強優(yōu)”三年行動計劃項目;上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院教學(xué)項目(QK-04)

王毅(1983—),女,主治醫(yī)師,Email:shennong-923@hotmail.com

胡智海(1975—),男,主任醫(yī)師,碩士,Email:zhh1708@hotmail.com