TRPV1受體參與脊髓電刺激對外周傷害性信息傳遞的抑制作用*

王培培 楊 菲,2

（1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100069；2首都醫(yī)科大學(xué)人腦保護(hù)高精尖中心，北京100069）

各種類型的神經(jīng)病理性疼痛在慢性疼痛中占據(jù)了相當(dāng)大的比例，但是很多情況下現(xiàn)有鎮(zhèn)痛藥物未能有效緩解神經(jīng)病理性疼痛病人的癥狀。脊髓電刺激 (spinal cord stimulation, SCS) 作為一種非藥物治療手段，對于一些藥物難于治療的神經(jīng)病理性疼痛，例如腰椎手術(shù)失敗綜合征等具有明顯的治療效果，從而受到國內(nèi)外慢性痛治療和研究領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的廣泛關(guān)注[1～3]。盡管如此，SCS的鎮(zhèn)痛療效仍有很大的提升空間，其中部分原因是其鎮(zhèn)痛機制尚未完全闡明。在臨床前動物實驗中，發(fā)現(xiàn)50 Hz 的SCS治療可以緩解神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠的機械性痛覺過敏，并且其神經(jīng)生理學(xué)機制包括抑制傷害性傳入纖維 （C纖維）在脊髓背角的信息傳遞和整合，例如SCS可以抑制脊髓背角淺層C纖維誘發(fā)場電位的幅度和深層廣動力范圍神經(jīng)元C成分的放電數(shù)量[4,5]。此外，有報道稱SCS可以通過調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)，例如膽堿能[6]、5-羥色胺能[7]和阿片系統(tǒng)[8]達(dá)到鎮(zhèn)痛目的。最近有研究報道[4]，CB1 (cannabinoid type 1) 受體的拮抗劑AM251可以阻斷SCS對神經(jīng)病理性疼痛大鼠機械性痛敏的緩解，并減弱SCS對脊髓背角淺層C纖維突觸傳遞的抑制。但是，CB2受體拮抗劑沒有對SCS產(chǎn)生的傷害性傳遞抑制產(chǎn)生明顯影響。以上結(jié)果說明脊髓節(jié)段的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在SCS對神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛中發(fā)揮作用。

內(nèi)源性大麻素作為一類具有生物活性的脂質(zhì)信號分子，可以參與調(diào)控傷害性信息傳遞和突觸可塑性變化，從而影響痛覺抑制的維持時間[9]。內(nèi)源性大麻素主要包括N-花生四烯酸氨基乙醇 (anandamide, AEA) 和2-花生四烯酸甘油 (2-arachidonoyl glycerol, 2-AG)，相應(yīng)的作用受體主要是大麻素1型 CB1和 2型 (cannabinoid type 2, CB2) 受體[10]。除了CB1和CB2受體，內(nèi)源性大麻素特別是AEA還可以作用于瞬時受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1) 受體[11]。外周神經(jīng)系統(tǒng)中的TRPV1受體主要作為傷害性感受器感知溫度和化學(xué)刺激，但脊髓的TRPV1受體可以參與C纖維的長時程突觸可塑性調(diào)節(jié)，而其是否參與SCS對C纖維突觸傳遞的抑制作用尚不得而知。同時，SCS對脊髓背角淺層和深層傷害性信息傳遞的抑制是否具有不同機制也缺少報道。因此，本研究通過在體電生理技術(shù)分別記錄脊髓背角淺層 （I-II層）的C纖維誘發(fā)場電位(C-fiber evoked local field potential, C-LFP) 和深層（III-V層）的廣動力范圍 (wide dynamic range, WDR) 神經(jīng)元，使用TRPV1受體拮抗劑AMG9810研究脊髓TRPV1受體是否參與SCS引發(fā)的C纖維傳遞抑制。同時，通過背根神經(jīng)節(jié)局部注射TRPV1激動劑樹膠脂毒素(resiniferatoxin, RTX) 清除外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPV1受體，進(jìn)一步探究脊髓背角突觸前TRPV1受體是否參與了SCS的抑制作用。

方 法

所有程序均由首都醫(yī)科大學(xué)批準(zhǔn)，實驗過程中對動物的處置遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部 2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》，以確保最小的動物使用量并減少其不適。大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，并在隔離籠中保持12 h/12 h晝夜循環(huán)。在實驗結(jié)束時通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉 (100～300 mg)處理所有動物。

1.實驗對象

本實驗中所使用的SPF級成年雄性250～300 g的Sprague-Dawley大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，均由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買和飼養(yǎng)。

2.儀器設(shè)備

電生理放大器 (World Precision Instruments,DAM80)；鎢絲電極 (FHC)；刺激器 (A-M Systems,Model 2100)；濾波器 (Krohn-hite, Model 3362)；數(shù)據(jù)采集系統(tǒng) (Cambridge Electronic Design Limited,Power1401-3A)。

3.主要藥品

TRPV1受體拮抗劑AMG9810（Tocris，脊髓表面給藥，50 mg/100 μl）；TRPV1受體激動劑Resiniferatoxin (RTX, Sigma Aldrich，背根神經(jīng)節(jié)注射，200 ng/10 μl)。

4.L5脊神經(jīng)結(jié)扎 (spinal nerve ligation, SNL)模型

大鼠經(jīng)1.5%～2%的異氟烷麻醉后，暴露并移除左側(cè)椎骨L6節(jié)段的橫突，使用6-0絲線對左側(cè)L5脊神經(jīng)進(jìn)行緊結(jié)扎，并于結(jié)扎點遠(yuǎn)心端剪斷神經(jīng)。手術(shù)后監(jiān)測動物是否有傷口感染、食物和水?dāng)z入不足或體重減輕癥狀，直至手術(shù)部位愈合。

5.背根神經(jīng)節(jié)注射

大鼠經(jīng)1.5%～2%的異氟烷麻醉后，于背部左側(cè)中線切開皮膚約3 cm，鈍性分離肌肉，暴露L4到L6節(jié)段椎骨。使用咬骨鉗小心移除L4節(jié)段橫突，暴露L4背根神經(jīng)節(jié)。使用微量注射器緩慢注入10 μl RTX溶液或等量vehicle（1%乙醇溶液）。

6.在體電生理記錄

（1）復(fù)合動作電位記錄：使用異氟烷 (1.5%)麻醉大鼠，進(jìn)行氣管切開術(shù)和機械提供通氣 (Kent Scientific Corporation, Litchfield, CT)。本實驗中將單極銀鉤電極置于左側(cè)坐骨神經(jīng)上以記錄復(fù)合動作電位 (compound action potential, CAP)，通過硬膜外電極施加不同強度電刺激誘發(fā)逆行的坐骨神經(jīng)CAP(0.1～5.0 mA，0.2 ms)。在線確定了導(dǎo)致第一個可檢測A/波形 (Ab0) 和峰值A(chǔ)/波形 (Ab1)，但不會產(chǎn)生A或C纖維成分的電流閾值，以此作為參照在接下來的實驗中設(shè)定SCS的刺激強度。

（2）局部場電位記錄：異氟烷麻醉下 (1.5%) 的大鼠暴露L4脊髓節(jié)段，去除硬腦膜，使用微電極推進(jìn)器將鎢絲電極下至左側(cè)脊髓背角淺層200～500 μm。通過電刺激左側(cè)坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角局部場電位 (local field potential, LFP)，采樣頻率寬度設(shè)為1～300 Hz，根據(jù)不同的潛伏期和閾值區(qū)分A纖維和C纖維誘發(fā) (90～130 ms，7～13 V) 成分。使用基于計算機的實時數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng) (CED Spike 2,UK) 來收集模擬數(shù)據(jù)。在SCS前15 min和SCS后0～30 min，使用坐骨神經(jīng)上的測試電刺激 (25 V，0.5 ms，每分鐘1個測試) 誘發(fā)C纖維誘發(fā)場電位(C-fiber evoked field potential, C-LFP)。

廣動力范圍神經(jīng)元記錄：手術(shù)過程與LFP記錄相同，記錄電極深入脊髓背角深層500～1 000 m，采樣頻率寬度為1～1 kHz。通過機械刺激左側(cè)足底尋找廣動力范圍 (wide dynamic range, WDR) 神經(jīng)元，確定后通過坐骨神經(jīng)電刺激誘發(fā)WDR神經(jīng)元反應(yīng)，并通過興奮閾值和潛伏期區(qū)分其中的A成分和C成分。在SCS前，SCS后15和30 min分別記錄逐漸增加電刺激 (1～10 mA) 誘發(fā)的WDR神經(jīng)元C成分放電數(shù)量，以觀察SCS對WDR神經(jīng)元傷害性反應(yīng)的抑制作用。

7.實驗分組

實驗中共使用36只SD大鼠用于SNL造模，造模后分成兩組各18只，分別用于C-LFP記錄和WDR神經(jīng)元記錄。每組的18只大鼠在電生理實驗前5天在背根神經(jīng)節(jié)注射溶媒（SCS + vehicle和SCS + AMG9810組，各6只）或RTX（SCS + RTX組，6只）。在電生理記錄當(dāng)天，SCS + vehicle組和SCS + RTX組在脊髓表面給予AMG9810的溶媒。

8.統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤()呈現(xiàn)。統(tǒng)計方法采用雙因素方差分析和Bonferroni多重比較檢驗，P< 0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.在體電生理記錄CAP, C-LFP和WDR神經(jīng)元

為檢測SCS對C-LFP和WDR神經(jīng)元反應(yīng)性的抑制作用，在SNL造模后3～4周對大鼠進(jìn)行在體電生理記錄（見圖1A）。首先，通過雙極電極刺激大鼠左側(cè)T13至L1脊髓節(jié)段的背柱組織，可以在同側(cè)坐骨神經(jīng)記錄到逆行的復(fù)合動作電位 (CAP)。根據(jù)潛伏期和刺激強度的不同，CAP可以被分成Aα/β和Aδ成分。將剛剛誘發(fā)出可檢測的Aα/β成分的電流強度定義為Aβ閾值 (Ab0)，而能夠誘發(fā)出Aα/β成分最大值，同時沒有激活A(yù)δ和C纖維成分的電流強度被定義為Aβ峰值(Ab1)（見圖1B）。在后續(xù)實驗中的SCS都將使用5 min，50 Hz，Ab1強度的刺激模式。在確定了SCS刺激強度后，我們通過電刺激坐骨神經(jīng)，在脊髓背角淺層或深層分別尋找LFP或者WDR神經(jīng)元。根據(jù)潛伏期的不同，脊髓LFP（見圖1C）和WDR（見圖1D）神經(jīng)元反應(yīng)可以分為A纖維誘發(fā)的早成分 (A-component) 和C纖維誘發(fā)的晚成分 (C-component)。

2.阻斷或清除TRPV1受體可以減弱或反轉(zhuǎn)SCS對C-LFP的抑制作用。

在溶媒對照組中，當(dāng)給予SCS (5 min, 0.2 ms,50 Hz, Ab1)后，C-LFP的曲線下面積出現(xiàn)了即刻的下降，并且在刺激后0～10 min內(nèi)相比于基礎(chǔ)值有統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2A, B）。而SCS對C-LFP的抑制作用維持時間較短，停止刺激15 min后回到了基線水平。而如果在脊髓表面給予AMG9810后15 min再給予相同參數(shù)的SCS，C-LFP曲線下面積的下降程度得以減弱，并且刺激后0～10 min內(nèi)的統(tǒng)計值和基礎(chǔ)值相比無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2A, B）。

圖1 電生理記錄模式圖和典型圖Fig.1 Setup and represent figure of Electrophysiological recording

背根神經(jīng)節(jié)局部注射RTX后5天，會造成外周TRPV1陽性神經(jīng)元死亡，從而清除外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPV1受體。相比于溶媒組（與圖2A中相同），經(jīng)RTX處理過的SNL大鼠在給予SCS后C-LFP的曲線下面積沒有出現(xiàn)縮小，反而逐漸增大，并在10～30 min期間相比于基礎(chǔ)值具有統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2C, D）。

3.清除外周TRPV1受體可以延長SCS對WDR神經(jīng)元C成分的抑制。

通過在坐骨神經(jīng)上施加電流強度 (0.1, 0.2, 0.3,0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10 mA)逐漸增大的電刺激，WDR神經(jīng)元的C纖維成分逐漸增多。在溶媒對照組中，給予SCS后0～15 min內(nèi)，WDR神經(jīng)元的C纖維反應(yīng)受到抑制，并具有統(tǒng)計學(xué)差異 （見圖3A, D）。而刺激后30～45 min內(nèi)，C纖維反應(yīng)逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)值水平。在SCS刺激之前15 min脊髓表面給予AMG9810，并沒有對SCS后WDR神經(jīng)元C成分抑制的程度和時程產(chǎn)生顯著影響（見圖3B, D）。而在經(jīng)RTX處理過的大鼠中，SCS的抑制作用甚至得以延長，表現(xiàn)為SCS后0～15和30～45 min時C纖維反應(yīng)相比于基礎(chǔ)值均有顯著下降（見圖3C, D）。

圖2 TRPV1受體參與SCS對C-LFP的抑制作用 (n = 6,EM)Fig.2 TRPV1 receptors are involved in the inhibition of C-LFP by SCS (n = 6,EM)

討 論

SCS作為一種行之有效的鎮(zhèn)痛手段，其最初建立就是基于Wall和Melzack在1965年提出的疼痛門控理論(gate control theory, GCT)。因此，闡明脊髓節(jié)段的鎮(zhèn)痛機制對于解釋和改進(jìn)SCS的鎮(zhèn)痛效果具有重要的研究價值和意義。在之前的一系列研究中，作者已經(jīng)在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中廣泛證明了50 Hz的SCS可以緩解機械性痛覺過敏[4,12]。此外，利用在體電生理技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)SCS后神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角的C-LFP和WDR神經(jīng)元C纖維成分的興奮性都受到明顯抑制[13,14]。同時，脊髓節(jié)段的內(nèi)源性大麻素和CB1受體參與了SCS對C-LFP的抑制作用。在本研究中，作者針對內(nèi)源性大麻素的潛在受體TRPV1在SCS對C-LFP和WDR神經(jīng)元的傷害性傳遞抑制中的作用開展了進(jìn)一步的探索。研究結(jié)果顯示，脊髓節(jié)段局部給予TRPV1受體拮抗劑AMG9810可以減弱給予50 Hz SCS后C-LFP曲線下面積的縮小，但不影響SCS對WDR神經(jīng)元C成分的抑制。利用TRPV1受體激動劑RTX，我們清除了外周的TRPV1受體及其陽性神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在RTX處理的神經(jīng)病理性疼痛大鼠中SCS不能抑制C-LFP，但是對WDR神經(jīng)元C成分的抑制反而被延長。以上的結(jié)果提示，50 Hz SCS對脊髓背角淺層和深層傷害性信息傳遞抑制具有不同的潛在機制，而脊髓突觸前TRPV1受體在其中發(fā)揮不同的功能。

圖3 SCS對WDR神經(jīng)元C成分抑制作用中TRPV1受體的功能 (n = 6,EM)Fig.3 The role of TRPV1 receptors in SCS-induced inhibition of C-component of WDR neuronal responses (n = 6,EM)

TRPV1受體在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，尤其是在外周背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglia, DRG) 神經(jīng)元胞體和纖維上，脊髓中TRPV1受體也主要表達(dá)在DRG神經(jīng)元傳入纖維的末梢端，即突觸前膜上。DRG神經(jīng)元外周端上的TRPV1受體是一種非常重要的傷害性感受器，可以感受熱、化學(xué)等傷害性刺激，并參與慢性痛的病理進(jìn)程[15]。而脊髓突觸前膜上的TRPV1則可以通過通透鈣離子，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。作者之前的研究也顯示，脊髓TRPV1可以參與突觸可塑性，例如參與電刺激或傷害性刺激誘發(fā)的脊髓長時程增強(long term potentiation,LTP)[16]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，SCS可以誘發(fā)C-LFP和WDR神經(jīng)元C成分反應(yīng)的短時程抑制，即一種短時程的突觸可塑性改變。本研究也首次發(fā)現(xiàn)脊髓的TRPV1受體參與這種短時程的突觸可塑性變化，但這種參與具有脊髓層面的特異性，背后機制的差異還有待具體研究。

TRPV1受體激動劑RTX可以通過過度激活TRPV1受體，引起大量陽離子內(nèi)流，從而殺死TRPV1陽性的外周神經(jīng)元，進(jìn)而清除外周TRPV1受體[17]。在本實驗中，也利用這一方法，特異性的清除外周DRG神經(jīng)元上的TRPV1受體，來研究脊髓背角突觸前膜上TRPV1受體在SCS中的作用。但由于RTX注射后所剩下的C纖維均為TRPV1陰性，其生理特性與TRPV1陽性C纖維本就不同，例如TRPV1陰性C纖維多為非肽能，而TRPV1陽性纖維多為肽能。因此SCS在RTX處理后大鼠中對C纖維突觸傳遞的抑制作用變化不能僅僅解釋為TRPV1缺失，也有可能是因為C纖維構(gòu)成的改變所導(dǎo)致的，這一點需要在未來的實驗中加以鑒別。