黑靈芝多糖對丙烯酰胺致大鼠肝臟氧化 損傷的保護作用

江國勇，雷艾彤，楊 瑩，余 強，謝建華，陳 奕

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)化學(xué)品，同時還普遍存在于炸、烘、烤等高溫食品中，與人類生活環(huán)境密切相關(guān)[1-3]。然而，AA具有多種生理毒性，已被國際癌癥研究機構(gòu)列為“可能人類致癌物”（2A類）[4]。由于AA是一種水溶性小分子物質(zhì)，滲透性強，人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收AA，在消化過程中可以快速分布于全身的組織中造成毒性[5]。肝臟是AA毒性的靶器官之一，研究表明AA能誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），消耗解毒過程中的重要物質(zhì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）并引起脂質(zhì)過氧化（丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增高），引起肝細胞氧化損傷[6-8]。

以往對AA的研究主要集中在其形成抑制方面，尤其是在熱加工過程中如何采取各種措施以降低食品中AA的含量，然而，中西方飲食習(xí)慣導(dǎo)致人體無法避免地長期暴露在低水平AA環(huán)境下。因此如何削弱AA體內(nèi)毒性，尋找可拮抗AA毒性的天然產(chǎn)物，構(gòu)建人類AA毒性防護的第二道屏障具有重要意義。近年來大量研究表明，多種植物來源天然產(chǎn)物對生物來源的ROS具有顯著的清除和抑制作用。Gedik[9]和Shrivastava[10]等研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花素和橙皮素處理AA染毒的大鼠后，抗氧化酶活力得到顯著提升，炎癥緩解，一定程度上緩解了AA毒性。Alturfan等[11]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對AA致大鼠氧化應(yīng)激和DNA氧化損傷起到保護作用。大型植物真菌黑靈芝（Ganoderma atrum）在我國作為藥食同源食品已有2 000多年歷史，然而關(guān)于黑靈芝來源的天然產(chǎn)物對于AA體內(nèi)毒性的抑制作用尚無報道。本課題組的前期研究[12-13]報道了一種從黑靈芝子實體中分離出的黑靈芝多糖（Ganoderma atrumpolysaccharides，PSG），對其結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)，PSG的主要水溶性成分PSG-1是一種由酸性1,3-糖苷鍵連接支鏈、1,6-糖苷鍵連接β-Glcp主鏈的雜多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其分子質(zhì)量為1 013 kDa，由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸以物質(zhì)的量比為4.91∶1∶1.28∶0.71組成。眾多體內(nèi)外研究表明PSG具有抗氧化防御能力，能夠改善過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，在清除自由基功能方面尤其突出[14-16]。

本課題組最近一項研究[17]表明，PSG能通過改善IEC-6細胞氧化應(yīng)激和線粒體凋亡途徑有效抑制AA毒性，然而到目前為止，關(guān)于PSG對AA誘導(dǎo)的肝臟損傷是否具有保護作用鮮見報道。因此，本研究旨在探討PSG對AA誘導(dǎo)大鼠肝臟氧化損傷的保護作用，以期為PSG的充分應(yīng)用與深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，同時為AA膳食防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑靈芝購于江西贛州靈芝基地。清潔級雄性SD大鼠（體 質(zhì)量160～180 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，使用許可證號：SYXK（贛）2005-0001）購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

AA（純度＞99.9%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceroles，TG）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、BCA蛋白濃度試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）-1β、 I L-1 0 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 武漢博士德 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15高速臺式離心機 德國Sigma公司；3001全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（多功能酶標儀） 美國Thermo公司；A10超純水儀 美國Millipore公司；2HWY-2102生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器公司；KZ-II組織破 碎儀 武漢塞維爾生物科技有限公司；AL104型電子 天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PSG的提取制備

黑靈芝子實體經(jīng)粉碎機反復(fù)粉粹處理至粉狀細微顆粒，用體積分數(shù)95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良的熱水浸提醇沉法提取PSG。將浸提液旋蒸濃縮至原體積1/5，采用Sevag法脫蛋白處理，脫蛋白后依次用自來水透析2 d、蒸餾水透析1 d、超純水透析1 d，再用體積分數(shù)95%乙醇溶液沉淀，沉淀物分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醚各洗滌2 次，濃縮，冷凍干燥，得到精制PSG。

1.3.2 AA誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型的建立

選取健康雄性SD大鼠60 只，體質(zhì)量160～180 g，于12 h明暗交替條件下適應(yīng)1 周。隨機分為6 組，每組10 只：1）正常組：等體積的生理鹽水；2）模型組：20 mg/kgmbAA溶液；3）陽性對照組：200 mg/kgmbN-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）；4）PSG低、中、高劑量組：PSG 50、100、200 mg/kgmb。各給藥組在給予相應(yīng)藥物0.5 h后，口腔灌胃AA水溶液，連續(xù)30 d。最后1 次給藥后，禁食不禁水18 h處死，進行相關(guān)指標測定。

1.3.3 大鼠一般情況觀察

實驗期間觀察大鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、有無死亡情況等，拍照并記錄。

1.3.4 肝臟病理檢測

取大鼠肝臟部分右葉（后續(xù)測定取肝臟左葉相應(yīng)部位），生理鹽水清洗，濾紙吸干，于體積分數(shù)10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，光鏡下觀察組織切片并拍照。

1.3.5 肝功能指標測定

采用眼球取血法，室溫放置2 h，待血清分層后于4 000 r/min、4 ℃下冷凍離心10 min，吸取上層血清部分，－80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。按照檢測試劑盒步驟測定血清ALT、AST、ALP活力和TG濃度。

1.3.6 肝臟氧化指標測定

稱取100 mg肝臟組織加入900 μL生理鹽水制備肝臟組織勻漿液，于8 000 r/min、4 ℃下離心15 min，吸取上清液，根據(jù)檢測試劑盒步驟測定SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3.7 免疫指標測定

采用1.3.5節(jié)所制血清樣品，按照檢測試劑盒步驟測定血清IL-Iβ、IL-10質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗均重復(fù)3 次， 結(jié)果以平均值±標準差表示；采用Graph Pad Prism 6 軟件作圖；采用單因素方差分析和Tukey’s多因素t檢驗進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況觀察及死亡率

在AA造模期間，各組大鼠均未出現(xiàn)中毒死亡。AA染毒第20天，模型組大鼠開始出現(xiàn)抱團嗜睡、后肢癱瘓并容易被激怒的現(xiàn)象，且毛發(fā)凸起失去光澤（圖1B），表明灌胃AA第20天AA的蓄積毒性作用開始體現(xiàn)。

圖 1 AA造模期間大鼠一般情況Fig. 1 General conditions of normal and AA-treated rats

2.2 PSG對AA致大鼠肝臟組織病理變化的影響

圖 2 PSG對AA致大鼠肝臟損傷的組織病理變化影響 （HE染色）（200×）Fig. 2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on AA-induced hist opathological changes in rats (HE staining) (200 ×)

由圖2可知：正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞以中央靜脈為中心，向四周呈發(fā)散性排列，細胞排列致密，肝細胞索排列規(guī)律，無充血和炎性細胞浸潤，核仁清晰（圖2A）；模型組肝索斷裂，細胞質(zhì)大量丟失，空泡嚴重，且細胞核固縮較嚴重，出現(xiàn)炎癥細胞浸潤 （圖2B）；相對于模型組，陽性對照組和PSG低劑量組肝索恢復(fù)，核仁清晰，排列整齊，空泡化現(xiàn)象基本緩解，僅有少量細胞質(zhì)丟失（圖2C、D）；PSG中、高劑量組基本接近于正常組（圖2E、F）。上述結(jié)果表明，AA染毒使大鼠肝細胞核固縮，細胞質(zhì)丟失，導(dǎo)致肝細胞壞死，從而損傷肝臟組織；而PSG和陽性藥物干預(yù)處理后，肝細胞組織形態(tài)趨于正常，提示PSG對AA致大鼠肝臟損傷具有較好的保護作用。

2.3 PSG對AA致大鼠肝臟功能損傷的影響

圖 3 PSG對AA致大鼠肝功能損傷的影響Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on liver function injury induced by AA in rats

由圖3可知，與正常組相比，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP活力均極顯著升高（P＜0.01），TG濃度顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，NAC處理后，陽性對照組大鼠血清中AST活力和TG濃度得到一定程度降低，但不顯著，ALT和ALP活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，低、中、高劑量PSG處理后，大鼠AST、ALT、ALP活力和TG濃度均極顯著降低（P＜0.01），降低程度遠大于陽性對照組。結(jié)果表明，AA染毒后各項肝功能指標顯示大鼠肝臟受到損傷，同時PSG對AA致大鼠肝損傷具有顯著的保護作用，且其效果遠遠優(yōu)于NAC。

2.4 PSG對AA致大鼠肝臟氧化損傷的影響

氧化應(yīng)激是肝臟損傷的重要機制之一。體內(nèi)自由基代謝的平衡主要通過抗氧化系統(tǒng)維持，主要包括SOD、GSH-Px、CAT等，MDA是脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物，MDA的含量也能間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[18]。

由表1可知，模型組大鼠中MDA含量極顯著高于正常組（P＜0.01），NAC和低、中、高劑量PSG均能夠極顯著降低大鼠體內(nèi)MDA含量（P＜0.01）。灌胃AA后，肝組織抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力均極顯著降低（P＜0.01），而NAC和不同劑量PSG處理均能不同程度地提升抗氧化酶活力，且PSG尤其是高劑量時，其提升抗氧化酶活力的能力遠大于NAC。結(jié)果提示，PSG能夠維持大鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，提高抗氧化酶活力，同時降低脂質(zhì)過氧化，從而緩解AA導(dǎo)致的大鼠肝臟損傷。

2.5 PSG對AA致大鼠肝臟損傷中血清炎癥因子水平的影響

圖 4 PSG對AA致大鼠肝臟損傷中血清炎癥因子IL-1β（A）、IL-10（B）質(zhì)量濃度的影響Fig. 4 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on serum IL-1β (A) and IL-10 (B) levels in rats with AA-induced liver injury

炎癥細胞因子參與炎癥反應(yīng)，在眾多炎癥細胞因子中，起主要作用為IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子等。由圖4可知，與正常組相比，模型組大鼠中血清IL-1β質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組和PSG處理組大鼠體內(nèi)IL-1β質(zhì)量濃度均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量PSG能夠極顯著提高血清IL-10質(zhì)量濃度（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，灌胃不同劑量的PSG均可以有效緩解AA導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，抑制AA誘導(dǎo)的大鼠肝組織中促炎細胞因子IL-1β的表達，并提高抗炎因子IL-10水平，從而達到對肝臟的保護作用。

3 討 論

AA對人類健康造成潛在的重大風(fēng)險，包括致突變性、遺傳毒性、致癌性[19]。肝臟是主要的解毒代謝器官，因此也成為AA的主要靶器官之一。本實驗結(jié)果表明，AA處理后，大鼠血清AST、ALT和ALP活力 （P＜0.01）及TG濃度（P＜0.05）顯著或極顯著增加。ALT和AST是動物體內(nèi)2 種重要的轉(zhuǎn)氨酶，正常情況下在血清中很少，但當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時，肝細胞結(jié)構(gòu)受到一定破壞，AST、ALT就會漏出至血液，因此血清中AST、ALT活力變化可以作為肝臟受到損害時的一種應(yīng)答反應(yīng)[20-21]。 肝臟受損時膽汁循環(huán)受阻，ALP活力升高，同時導(dǎo)致機體對游離脂肪酸的利用減少，血液中游離脂肪酸水平升高，導(dǎo)致血清中TG濃度升高，因此血清中TG濃度也間接反映了肝臟受損程度[22]。氧化應(yīng)激是AA損傷的主要機制之一[2]。Jiang Guoyong等[17]的研究結(jié)果提示，在IEC-6細胞模型中，AA能刺激IEC-6細胞產(chǎn)生過量ROS。Ghorbel等[1]發(fā)現(xiàn)不同劑量的AA可誘導(dǎo)破壞肝細胞中促氧化劑和抗氧化劑平衡而引起氧化損傷。機體接觸AA后會通過酶與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生ROS。當(dāng)ROS增多至超過機體清除自由基能力時，機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)就會失衡，從而發(fā)生氧化損傷。Luo等[23]研究發(fā)現(xiàn)AA及其代謝物（縮水甘油酰胺）能與GSH結(jié)合形成共軛異構(gòu)體，AA給藥后體內(nèi)GSH水平降低。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，GSH消耗可能會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物。MDA水平升高提示機體可能發(fā)生了氧化損傷，機體抗氧化系統(tǒng)平衡遭到破壞[24]。當(dāng)機體氧化應(yīng)激第一道防線被突破，過多的ROS開始攻擊DNA生物大分子，引起DNA損傷。氧化應(yīng)激通過核因子κB激活產(chǎn)生炎癥因子并發(fā)生炎癥 反應(yīng)[25]。因此本研究采用自由基清除能力突出的PSG干預(yù)AA毒性作用，并進行肝臟組織病理觀察，測定血清AST、ALT、ALP活力、TG濃度等肝臟功能指標，機體氧化與抗氧化系統(tǒng)狀態(tài)，及相關(guān)免疫因子評價AA誘導(dǎo)的肝臟損傷情況。肝損傷組織病理學(xué)特征表明，與模型組大鼠相比，PSG處理緩解了AA誘導(dǎo)的肝細胞損傷。AA可以促進自由基產(chǎn)生并誘導(dǎo)肝組織損傷[26]。動物造模后各項肝功能指標均與正常組差異顯著（P＜0.01、P＜0.05），提示肝損傷模型成功。進一步評價機體氧化/抗氧化系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，AA處理后機體內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，抗氧化系統(tǒng)紊亂，主要表現(xiàn)為抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力極顯著降低（P＜0.01）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）含量極顯著升高（P＜0.01），最終導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化損傷，這與Yu Rongmin等[27]的研究結(jié)果相一致。在氧化損傷情況下，ROS攻擊生物大分子并促使機體產(chǎn)生炎癥因子。本實驗中，AA處理后大鼠體內(nèi)促炎因子IL-1β質(zhì)量濃度極顯著上升（P＜0.01）。

PSG良好的生物功能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密不可分。本課題組前期研究中，PSG具有良好的體外抗氧化活性，這可能主要歸因于其中的酚類和蛋白質(zhì)成分[28]。文獻[29]報道，真菌提取物中常見的酚類化合物，如酚酸類、酚類衍生物具有良好的抗氧化活性。酚類物質(zhì)的抗氧化活性可認為是氫在氧化反應(yīng)中充當(dāng)了H－或者電子供體的角色，最終終止氧化電子反應(yīng)鏈[30]。另外，抗氧化活性多肽或蛋白中典型的氨基酸包括親核含硫氨基酸、芳香族氨基酸、咪唑氨基酸等組分也在PSG中發(fā)現(xiàn)[12]。進一步探討其與免疫活性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PSG免疫活性與其蛋白質(zhì)、總酚、中性糖含量均無明顯關(guān)系，但與糖醛酸含量呈現(xiàn)線性關(guān)系，其中酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖結(jié)構(gòu)對PSG發(fā)揮免疫活性具有關(guān)鍵性作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，作為天然活性產(chǎn)物來源，PSG可以提高AA誘導(dǎo)肝損傷大鼠體內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px） 活力，降低促炎因子（IL-1β）、提高抗炎因子（IL-10）質(zhì)量濃度，一定程度地恢復(fù)肝臟功能和修復(fù)組織病理損傷。PSG對AA誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷具有保護作用，作用機制可能與其酚類蛋白成分的抗氧化作用和酸性β-(1→3,1→6)葡聚糖結(jié)構(gòu)的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。上述研究對于治療或早期預(yù)防AA毒性具有重要的理論意義和實踐價值，也能為膳食營養(yǎng)提供科學(xué)指導(dǎo)和實驗依據(jù)，同時也為以PSG為原料的高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供積極的影響。