空化微射流對生物酶法豆渣蛋白結(jié)構(gòu)影響的 拉曼光譜分析

李 楊，和銘鈺，吳長玲，高 悅，王中江，李 萌，江連洲，滕 飛,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆種植現(xiàn)已遍布我國各個地區(qū)，主要種植區(qū)域位于東北、華北及長江下游地區(qū)，其中黑龍江為大豆主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)品品質(zhì)較佳[1-2]。與傳統(tǒng)制油工藝相比，生物酶法制油技術(shù)可同時提取油及蛋白，且處理?xiàng)l件溫和，所得產(chǎn)品品質(zhì)較高；同時，生物酶法制油技術(shù)現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其加工副產(chǎn)物產(chǎn)量可觀但未充分利用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，極大地限制了生物酶法技術(shù)的經(jīng)濟(jì)可行性[3-6]。多年來，國內(nèi)外對豆渣的研究主要集中在多糖、膳食纖維、大豆異黃酮等方面，對豆渣蛋白的研究鮮少[7-8]。因此，生物酶法制油豆渣作為一種營養(yǎng)豐富、天然、低熱量、低脂肪、低糖的食品原料具有很大的發(fā)展?jié)摿9]。

空化微射流技術(shù)是一種新型物理改性技術(shù)，它集高速沖擊、高頻振動、高速剪切、超微粉碎、瞬時降壓等多種處理技術(shù)于一體，從而改變生物大分子物質(zhì)的物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性，并提高物質(zhì)功能活性。近幾年，有研究指出空化微射流處理對于改善蛋白結(jié)構(gòu)具有顯著功效[10-12]。同時，Shen Lan等[13]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)微射流處理后，熱聚集大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的溶解度及表面疏水性顯著提高，分子間二硫鍵構(gòu)型改變，并有效改善蛋白乳化特性。Oliete等[12]研究了空化微射流調(diào)節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體的乳化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微射流加工過程的空穴效應(yīng)導(dǎo)致球蛋白聚集體內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排，從而提高了蛋白聚集體的乳液穩(wěn)定性。綜上所述，空化微射流技術(shù)能夠?qū)χ参锏鞍踪|(zhì)的理化性質(zhì)和構(gòu)象等產(chǎn)生顯著影響，與其他處理技術(shù)相比具有操作簡單、處理時間短、溫度低和效果獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，故本研究選用空化微射流技術(shù)處理生物酶法制油豆渣。

拉曼光譜是一種基于光散射效應(yīng)的分子分析技術(shù)，具有檢測快速、樣品需要量少且無需預(yù)處理及光譜清晰度高等優(yōu)點(diǎn)，已在石油生產(chǎn)、生物醫(yī)藥、環(huán)境污染檢測、寶石鑒定和文物鑒定等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。與其他光譜相比，拉曼光譜可獲得關(guān)于蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)變化的直接信息及其芳香族氨基酸的信息，并且對樣品無破壞性[14-15]。故本研究運(yùn)用拉曼光譜來分析豆渣蛋白結(jié)構(gòu)。

綜上所述，本研究以生物酶法制油豆渣為原料，運(yùn)用新型空化微射流技術(shù)處理豆渣，探討空化微射流技術(shù)對豆渣蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響，通過拉曼光譜分析技術(shù)深入解析不同處理時間下豆渣蛋白主碳鏈結(jié)構(gòu)及其側(cè)鏈基團(tuán)構(gòu)象變化，從豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化探討其影響機(jī)制。研究旨在充分發(fā)揮空化微射流加工技術(shù)的優(yōu)勢，高效回收豆渣蛋白，并改善其功能特性，為豆渣的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持，并為推動大豆副產(chǎn)物高值化進(jìn)程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物酶法制油豆渣，實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶Protex-6L（酶活力不小于10 000 U/g） 丹麥丹尼斯克有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S22-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司； AL204型分析天平、PL303型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DC-500A型高速多功能粉碎機(jī) 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、JJ-1精密增力電動攪拌器 常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C型雷磁pH計(jì) 上海精科儀器有限公司； TDL-408型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠； DHG-9146型鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限 公司；空化微射流均質(zhì)機(jī) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；Raman Station 400激光顯微拉曼光譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 生物酶法制油豆渣的制備

根據(jù)Li Yang等[16]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，將市售大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過60 目篩，取200 g過篩后的豆粉，按料液比1∶6（m/V）加入蒸餾水，攪拌均勻后放入55 ℃水浴鍋內(nèi)按照水酶法進(jìn)行酶解。酶解條件為：酶解溫度55 ℃、酶解時間2 h、pH值維持在9.0、堿性蛋白酶Protex-6L（8 900 U/mL）添加量為0.5%。用攪拌器邊攪拌邊酶解，酶解結(jié)束后，取出并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，之后在100 ℃沸水中滅酶5 min，滅酶后冷卻至室溫，在4 500 r/min、4 ℃條件下離心20 min，去除上層液體，僅保留下層豆渣，并在相同離心條件下按料液比1∶3（m/V）用去離子水將豆渣水洗3 遍，之后將豆渣在平板鋪平后置入55 ℃鼓風(fēng)烘箱，待質(zhì)量恒定后取出研磨，即得所需生物酶法制油豆渣。

1.3.2 空化微射流技術(shù)處理豆渣

稱取一定量研磨后的豆渣，按料液比1∶8（m/V）溶于去離子水中，采用空化微射流均質(zhì)機(jī)，對其進(jìn)行均質(zhì)處理，處理時間分別為5、10 min和15 min，處理溫度25 ℃，壓力0.1 MPa，同時以未經(jīng)過空化微射流處理（0 min）的樣品作為對照，離心（4 500 r/min、20 min、4 ℃）后沉淀干燥即可。

1.3.3 生物酶法制油豆渣蛋白等電點(diǎn)的確定

根據(jù)馬秀婷[17]的方法進(jìn)行測定，取過100 目篩的豆渣粉50 g，按料液比1∶22（m/V）加入蒸餾水，45 ℃下用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.5，水浴鍋攪拌提取1 h，pH值維持在9.5。在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液平均分為10 份，用1 mol/L HCl溶液分別調(diào)pH值至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，靜置2 h后在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液后稱質(zhì)量，重復(fù)一次，以pH值為橫坐標(biāo)、以沉淀蛋白質(zhì)量/原液質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，沉淀量最大時的pH值為豆渣蛋白等電點(diǎn)，從而確定其等電點(diǎn)為4.6。

1.3.4 豆渣蛋白的提取工藝

根據(jù)Tao Xia等[18]的方法進(jìn)行提取，取100 g豆粉用正己烷以1∶6（m/V）的比例混合攪拌1 h，4 ℃、 4 500 r/min離心20 min，脫脂，得到脫脂豆粕[19]，將脫脂豆粕按1∶20（m/m）的比例與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，常溫?cái)嚢? h后，將其懸浮液在4 ℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液。再用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至豆渣蛋白等電點(diǎn)4.6。靜置2 h后在4 ℃條件下7 000 r/min離心30 min，得蛋白沉淀用去離子水洗3 次，最后取沉淀溶解于水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。再在4 ℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀豆渣蛋白。

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1.3.5 空化微射流技術(shù)處理前后豆渣蛋白的拉曼光譜分析

運(yùn)用Raman Station 400拉曼光譜儀進(jìn)行測定。激發(fā)光波長7 8 5 n m，激光功率8 0 mW，掃描范圍400～2 000 cm－1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進(jìn)行累加。以苯丙氨酸（（1 003±1）cm－1）作為歸一化因子，作豆渣蛋白的拉曼譜圖。譜圖基線校正、譜峰歸屬查找采用ACD Labs V12軟件。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，利用SPSS Statistics 22 軟件，采用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin 9.5軟件、PeakFit 4.12軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣蛋白拉曼光譜分析結(jié)果

圖 1 不同空化微射流處理時間下豆渣蛋白拉曼光譜圖Fig. 1 Raman spectra of soybean dreg protein subjected to different durations of cavitation microjet treatment

為了有效分析經(jīng)空化微射流處理生物酶法制油豆渣中蛋白組分結(jié)構(gòu)特征，采用拉曼光譜技術(shù)在400～2 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行分析研究，結(jié)果如圖1所示。依據(jù)已有研究進(jìn)行各峰位歸屬，分別列于表1中[20]。由于拉曼譜帶的強(qiáng)度與散射中心的數(shù)目成正比，譜帶強(qiáng)度的變化即意味著散射中心（包括基團(tuán)和化學(xué)鍵）數(shù)目的變化。強(qiáng)度變小說明相應(yīng)譜帶所屬的基團(tuán)或化學(xué)鍵受到損傷。如果譜帶位移，則可能是相應(yīng)的基團(tuán)或化學(xué)鍵受到影響而發(fā)生變化的緣故。拉曼光譜中譜峰位置及強(qiáng)度的變化主要用于研究豆渣蛋白的二級結(jié)構(gòu)和疏水微環(huán)境的變化。

表 1 豆渣蛋白拉曼光譜特征頻率歸屬Table 1 Raman spectral characteristic frequency attribution of soybean dreg protein

2.2 豆渣蛋白主鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析結(jié)果

圖 2 豆渣蛋白酰胺I區(qū)分峰和迭代擬合曲線Fig. 2 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands of soybean dreg protein in amide I region

豆渣蛋白酰胺I帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 645～1 660 cm－1；β-折疊結(jié)構(gòu)，1 670～1 680 cm－1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 680～1 690 cm－1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 660～1 670 cm－1。將1 003 cm－1波段作為歸一化因子，此波段的苯丙氨酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被外界環(huán)境干擾。各譜中以它的強(qiáng)度作為1，在此基礎(chǔ)上計(jì)算了不同空化微射流豆渣蛋白溶液中各個基團(tuán)的譜帶強(qiáng)度變化率[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中豆渣蛋白的拉曼圖譜二級結(jié)構(gòu)的定量計(jì)算由PeakFit 4.12軟件完成，圖2所示為豆渣蛋白拉曼譜帶在1 600～1 700 cm－1區(qū)域內(nèi)的擬合圖譜。

表 2 空化微射流處理豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)組分相對含量Table 2 Relative contents of secondary structure components of soybean dreg protein treated by cavitation microjet %

不同空化微射流處理時間對酰胺I帶豆渣蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量變化情況如表2所示。研究發(fā)現(xiàn)，與未處理豆渣蛋白相比，經(jīng)空化微射流處理后豆渣蛋白的α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量顯著增加（P＜0.05）。另外，隨空化微射流處理時間延長，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量呈現(xiàn)先增加再降低的變化趨勢，當(dāng)處理時間達(dá)到10 min時，α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量達(dá)到最大為69.09%，β-轉(zhuǎn)角相對含量呈下降趨勢，而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量呈先下降再上升的變化趨勢。

上述結(jié)果表明空化微射流處理可以破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中氨基酸局部序列、氫鍵及其他分子間及分子內(nèi)相互作用基團(tuán)，從而導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)變化。與未處理豆渣蛋白相比，空化微射流的高速沖擊、振動、剪切作用使分子間相互作用減弱，非極性基團(tuán)暴露，導(dǎo)致分子間疏水作用減弱并破壞分子間氫鍵，使得豆渣蛋白α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量增加，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量下降；另一方面，空化微射流處理使豆渣蛋白分子間有序結(jié)構(gòu)增加，蛋白質(zhì)聚集，故α-螺旋和β-折疊構(gòu)象比例升高[23-25]。Sun Cuixia等[10]分析玉米醇溶蛋白在動態(tài)高壓微射流技術(shù)處理下分子鏈纏結(jié)和聚集，結(jié)果表明α-螺旋、β-折疊相對含量分別從57.1%、16.8%增加到59.4%、17.9%，β-轉(zhuǎn)角相對含量從8.6%下降至5.0%，印證了本研究中α-螺旋和β-折疊相對含量增加，β-轉(zhuǎn)角相對含量下降的結(jié)果。

處理時間達(dá)到10 min后，豆渣蛋白α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量降低，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量增加。隨著空化微射流時間的延長，豆渣蛋白分子間碰撞停止，繼續(xù)處理，氫鍵作用反而增大，導(dǎo)致α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)相對含量下降。同時，豆渣蛋白分子鏈解折疊，導(dǎo)致無規(guī)卷曲這種無序結(jié)構(gòu)相對含量增加。

2.3 豆渣蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析結(jié)果

表 3 空化微射流處理豆渣蛋白側(cè)鏈基團(tuán)譜帶強(qiáng)度Table 3 Side chain group band strength of soybean dreg protein treated by cavitation microjet

拉曼光譜中760 cm－1附近的區(qū)域表征色氨酸殘基的微環(huán)境及氫鍵的變化規(guī)律[26-28]。由表3所示，隨著空化微射流作用時間的延長，色氨酸譜帶強(qiáng)度表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。與未處理豆渣蛋白相比，經(jīng)空化微射流處理后豆渣蛋白拉曼光譜峰強(qiáng)度在760 cm－1附近區(qū)域顯著降低（P＜0.05），表明色氨酸殘基由包埋的疏水環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)楸┞对跇O性環(huán)境中，豆渣蛋白分子間疏水作用 減弱[29-30]。然而，當(dāng)作用時間超過10 min時，色氨酸譜帶強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），表明色氨酸又變?yōu)榘駹顟B(tài)，豆渣蛋白分子間疏水作用增強(qiáng)。Yang Feng等[31]研究了旋轉(zhuǎn)空化對SPI功能特性的影響，通過測定表面疏水性發(fā)現(xiàn)，旋轉(zhuǎn)空化可以減少分子間締合，導(dǎo)致SPI結(jié)構(gòu)的展開，疏水區(qū)域的暴露，表面疏水性顯著升高。表明空化作用會使豆渣蛋白分子展開，疏水基團(tuán)暴露，疏水性氨基酸呈“暴露態(tài)”。

2.3.2 酪氨酸殘基

酪氨酸殘基上對位取代苯環(huán)的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間能在830 cm－1和850 cm－1附近形成費(fèi)米共振雙峰，R值（R＝I850/I830，In表示譜帶在波數(shù)為n時的強(qiáng)度）反映了蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基的暴露與埋藏，是監(jiān)測酪氨酸殘基微環(huán)境的有效探針。當(dāng)R值在0.7～1.0時，酪氨酸殘基埋藏在分子內(nèi)部；當(dāng)R值小于0.3時，表明酪氨酸殘基中存在強(qiáng)氫鍵；當(dāng)R值大于1.0時，表明酪氨酸殘基暴露在水相或者極性環(huán)境中[32-33]。在本研究中，R值分布在1.10～1.20范圍內(nèi)，表明豆渣蛋白的酪氨酸殘基暴露于極性環(huán)境中，環(huán)上的羥基氧原子作為中性強(qiáng)度氫鍵的供體和受體。

由表3可知，R值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，表明空化微射流處理可以破壞維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，使豆渣蛋白酪氨酸殘基充分暴露，但隨著處理時間的延長，又會導(dǎo)致酪氨酸殘基暴露程度降低。

2.3.3 脂肪族氨基酸

1 450 cm－1可以表征CH2或CH3從蛋白質(zhì)側(cè)鏈和脂質(zhì)產(chǎn)生的振動彎曲，是脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜帶[34-35]。由表3可以看出，拉曼光譜中1 450 cm－1的譜帶強(qiáng)度隨著空化微射流時間的延長呈先下降后增加的趨勢。在本研究中，經(jīng)過5 min的空化微射流處理的、豆渣蛋白拉曼歸屬峰在1 450 cm－1附近區(qū)域顯著降低（P＜0.05），脂肪族氨基酸趨于“暴露態(tài)”，這與豆渣蛋白結(jié)構(gòu)的解折疊及二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變有關(guān)。然而，當(dāng)作用時間超過10 min時，脂肪族氨基酸譜帶強(qiáng)度顯著增加（P＜0.05），表明脂肪族氨基酸又埋藏在分子內(nèi)部。

2.4 豆渣蛋白二硫鍵拉曼光譜分析結(jié)果

二硫鍵的特征譜帶在500～550 cm－1范圍內(nèi)，并且與分子內(nèi)和分子間的巰基/二硫鍵相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。二硫鍵在不同振動模式下所反映出來的拉曼位移有所不同，其中，500～515 cm－1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm－1為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，525～545 cm－1為trans-gauche-trans（t-g-t）模式[36-37]。 為了探究空化微射流對豆渣蛋白二硫鍵的影響，運(yùn)用Peak Analyzer軟件進(jìn)行多峰值Guassian擬合。

圖 3 豆渣蛋白拉曼譜帶在490～560 cm－1區(qū)域內(nèi)的高斯擬合圖Fig. 3 Fitted Gaussian peaks of soybean dreg protein in the region of 490–560 cm-1

表 4 空化微射流處理豆渣蛋白在 500～550 cm－1區(qū)域擬合結(jié)果Table 4 Fitting results for soybean dreg protein subjected to cavitation microjet treatment in the 500–550 cm-1 region

從圖3可以看出，重新合成的擬合譜帶與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)貼近，證明擬合結(jié)果是準(zhǔn)確的。對擬合的各個高斯峰值進(jìn)行歸屬，不同空化微射流處理時間豆渣蛋白二硫鍵的振動模式歸屬如表4所示。經(jīng)空化微射流處理后，g-g-g和g-g-t模式比例呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，而t-g-t模式比例先增加后下降。隨著空化微射流時間的延長，二硫鍵變化明顯，原因是豆渣蛋白顆粒被破壞，使得包埋在內(nèi)部的游離巰基被氧化生成二硫鍵，造成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化。這與Oliete等[12]利用動態(tài)高壓流化技術(shù)調(diào)節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體，使得游離巰基含量減少，二硫鍵增多結(jié)果相似。同時t-g-t模式比例增加，當(dāng)處理時間達(dá)到10 min時，達(dá)到最大72.21%，表明豆渣蛋白分子間作用力增強(qiáng)，進(jìn)而形成一種趨于更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。隨著時間的延長，t-g-t模式比例降低，表明蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，豆渣蛋白分子間作用力減弱。

3 結(jié) 論

以生物酶法制油豆渣蛋白為原料，經(jīng)過不同時間的空化微射流處理，利用拉曼光譜分析豆渣蛋白的各種功能鍵與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)空化微射流處理10 min時豆渣蛋白效果最好。結(jié)果表明，空化微射流處理提高了豆渣蛋白的α-螺旋及β-折疊結(jié)構(gòu)含量，并降低了β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)；I760、I1450和I850/I830變化表明，疏水性氨基酸殘基暴露程度加深；空化微射流處理改變了豆渣蛋白的二硫鍵構(gòu)型，g-g-g和g-g-t模式比例降低，以及t-g-t模式比例增加。綜上，空化微射流技術(shù)可以改變生物酶法制油豆渣蛋白的二級結(jié)構(gòu)，對其有一定的積極作用，使豆渣蛋白無序結(jié)構(gòu)趨于有序化，提高其穩(wěn)定性，為豆渣蛋白在食品加工過程中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。