平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對小鼠黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移的抑制作用

李芳芳,管道坤,郭夢琦,任倩文,王洪波,田京偉

(煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學), 山東 煙臺, 264005)

平消膠囊現(xiàn)收載于2015年版 《中國藥典》 第一部成方制劑中, 是《腫瘤姑息治療中成藥使用專家共識 (2013版) 》重點推薦抑瘤類中成藥[1]. 平消膠囊由東漢張仲景所著《金匱要略》中的 “硝石礬石散” 化裁而成, 組方中含有郁金、仙鶴草、馬錢子、白礬、硝石、五靈脂、干漆和枳殼, 具有活血化瘀、清熱解毒和止痛祛邪等功效[2]. 藥典標識的功能與主治為活血化瘀,止痛散結(jié), 清熱解毒[3].

近年來, 癌癥的中西醫(yī)結(jié)合療法受到社會廣泛關注,中醫(yī)藥的作用在抗腫瘤方面日益突顯[4]. 抑瘤類中成藥可作為腫瘤治療的輔助用藥, 減輕放化療引起的毒副作用, 在臨床上常與標準的化療方案聯(lián)合使用[5]. 臨床研究顯示平消膠囊聯(lián)合索拉非尼可提高中晚期老年肝癌患者化療的臨床療效[6], 平消膠囊聯(lián)合大腸癌FOLFOX4方案可顯著提高癌術后患者的生存質(zhì)量[7]. 平消膠囊對于肺癌有著廣泛的適應癥和獨特的優(yōu)勢, 尤其對肺癌放化療有著明顯的減毒增效作用, 對延長患者的生存期、改善患者的生存質(zhì)量、降低復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移率具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景[8-9].

紫杉醇 (Paclitaxel, PTX) 是一種廣譜抗腫瘤藥,對多種惡性腫瘤顯示出肯定的臨床效果,也是晚期黑色素瘤一線治療的備選方案之一．紫杉醇屬于有絲分裂抑制劑, 通過促進微管蛋白聚合、抑制解聚、保持微管蛋白穩(wěn)定、抑制細胞有絲分裂和促進腫瘤細胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11]. 紫杉醇被美國FDA批準上市的第一個適應癥為晚期卵巢癌, 臨床應用中紫杉醇對其他實體瘤, 如肺癌、乳腺癌等也顯示出良好的治療效果[12]. 平消膠囊與紫杉醇聯(lián)合應用的臨床研究較少, 亦未發(fā)現(xiàn)臨床前的實驗研究. 為了更好地指導臨床用藥, 研究平消膠囊對紫杉醇抗腫瘤活性的影響, 本文建立了小鼠黑色素瘤 (B16) 皮下異體移植模型和肺轉(zhuǎn)移模型, 探索平消膠囊和紫杉醇聯(lián)用的抗腫瘤作用, 并對其作用機制進行了初步研究, 旨在為臨床合理用藥提供參考.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

平消膠囊購于西安正大制藥有限公司; 紫杉醇注射液購于揚子江藥業(yè)集團有限公司; 小鼠白細胞介素10 (Interleukin-10, IL-10) 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自于上海聯(lián)碩生物科技有限公司; DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購于美國 Gibco 公司; 胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術有限公司.

1.2 實驗動物

實驗所用C57BL/6小鼠 (雄性, 18～20 g) 購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司. 實驗開始前將動物置于12 h∶12 h晝夜交替節(jié)律的無特定病原體 (Specefic pathogenfree, SPF) 級標準實驗條件下分籠飼養(yǎng), 預適應至少一周. 所有實驗均按照中華人民共和國衛(wèi)生部和中國醫(yī)科大學動物保健委員會的指導原則進行. 研究方案經(jīng)煙臺大學實驗動物研究委員會批準.

1.3 實驗細胞與培養(yǎng)

B16黑色素瘤細胞株由中國醫(yī)學科學院藥物研究所陳曉光教授課題組友情饋贈. B16細胞用含10% 胎牛血清及100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基, 于 37 ℃、CO2體積分數(shù)為 5% 的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 2 ～ 3 d傳代一次. 取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)各項實驗.

1.4 B16黑色素瘤皮下異體移植瘤模型

1.4.1 模型建立 取生長狀態(tài)良好的 B16 細胞, 胰蛋白酶消化后用含血清培養(yǎng)基吹打制備單細胞懸液, 1 500 r/min離心5 min, 棄去上清. 加適量生理鹽水重懸, 1 500 r/min離心5 min, 棄去上清, 收集細胞, 此過程重復2次, 加生理鹽水將細胞密度調(diào)整為2×105個/mL. 取0.1 mL細胞懸液接種到小鼠的右側(cè)腋下, 生長2周后將瘤塊取出, 剝?nèi)∵m量形態(tài)較好的瘤組織稱重, 加4倍體積的生理鹽水研磨均勻制備瘤液. 將瘤液接種到小鼠的右側(cè)腋下, 每只0.1 mL.

1.4.2 分組及給藥 接種后的小鼠隨機分為4組, 每組5只, 分別為模型組、平消組、紫杉醇組和聯(lián)用組 (平消膠囊與紫杉醇). 紫杉醇注射液用無菌生理鹽水稀釋至給藥濃度, 平消膠囊研磨后以CMC-Na混懸. 于造模成功后第2天開始給藥: 模型組灌胃給予溶媒 (0.05% CMC-Na), 每日1次; 平消組(250 mg/kg), 灌胃, 每日1次; 紫杉醇組 (30 mg/kg), 腹腔注射, 每周2次; 聯(lián)用組 (平消膠囊250 mg/kg和紫杉醇30 mg/kg). 實驗過程中每2 d記錄小鼠的體重變化. 給藥2周后脫頸處死小鼠, 將瘤塊剝離并稱重.

1.5 B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型

1.5.1 模型建立 根據(jù)已報道的方法稍加優(yōu)化[13], 取對數(shù)生長期的 B16 細胞, 胰蛋白酶消化后用含血清培養(yǎng)基吹打制備單細胞懸液, 1 500 r/min離心5 min, 棄上清. 加適量生理鹽水重懸, 1 500 r/min離心5 min, 棄去上清, 收集細胞, 此過程重復2次. 加生理鹽水將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL, 通過尾靜脈注射的方式將細胞懸液注入小鼠體內(nèi), 每只0.1 mL.

1.5.2 分組及給藥 通過尾靜脈注射B16細胞的方式獲得模型小鼠共20只, 隨機分為4組, 每組5只, 分別為: 模型組, 平消組, 紫杉醇組, 聯(lián)用組 (平消膠囊與紫杉醇). 連續(xù)給藥18 d, 給藥方案同1.4.2.

1.5.3 小鼠肺組織檢查 B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型小鼠于末次給藥后脫頸處死, 小心剝離完整肺部組織置于體積分數(shù)為4% 的多聚甲醛磷酸緩沖液中固定, 48 h后取出, 進行梯度乙醇脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋后做連續(xù)切片, 片厚為4 μm, HE染色法對組織進行染色.

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法 (ELASA) 檢測小鼠血漿中IL-10含量 B16 黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型小鼠于末次給藥后, 經(jīng)右眼眶內(nèi)眥取出全血, 置于事先準備好的肝素離心管中. 3 500 r/min離心10 min, 取上層血清于-20 ℃冰箱中保存待用. 后續(xù)各步實驗操作均按照上海聯(lián)碩生物科技有限公司的小鼠IL-10酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進行.

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 平消膠囊可增強紫杉醇對B16皮下移植瘤生長的抑制作用

通過B16黑色素瘤皮下異體移植瘤模型研究平消膠囊對紫杉醇抗腫瘤活性的影響. 如圖1所示, 與模型組比較, 30 mg/kg的紫杉醇和250 mg/kg的平消膠囊單用均可顯著抑制黑色素瘤的生長(P< 0.05, 與模型組相比); 250 mg/kg的平消膠囊可顯著增強紫杉醇的抗腫瘤活性 (P< 0.05, 與紫杉醇組相比).

*:P<0.05,與模型組相比;#:P<0.05,與紫杉醇組相比.

圖1平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對B16移植瘤生長的影響

Fig.1 The effect of Pingxiao capsule combination with paclitax-el on the xenograft tumor growth of B16

2.2 平消膠囊可緩解紫杉醇引起的小鼠體重下降

實驗過程中, 記錄小鼠體重并進行分析. 結(jié)果如表1所示, 紫杉醇組小鼠的體重明顯下降 (P< 0.05, 與模型組相比), 聯(lián)合平消膠囊后可以部分緩解紫杉醇引起的小鼠體重降低幅度. 平消膠囊與紫杉醇聯(lián)用組和模型組小鼠相比體重下降但是不具有統(tǒng)計學差異.

表1 小鼠體重變化表

*:P< 0.05, 與模型組相比.

2.3 平消膠囊增強紫杉醇抑制小鼠肺轉(zhuǎn)移的藥理作用

給藥18 d后脫頸處死小鼠, 小心剝離完整肺組織并拍照. 結(jié)果如圖2所示, 模型組小鼠肺組織表面布滿黑色素瘤細胞. 與模型組相比, 平消膠囊和紫杉醇單用均能抑制黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移. 其中, 紫杉醇單用組抑瘤效果優(yōu)于平消單用組. 平消膠囊與紫杉醇聯(lián)用組小鼠肺組織表面的黑色素瘤體數(shù)量明顯減少, 呈點狀分布, 顯示兩藥聯(lián)用對黑色素瘤生長的抑制作用更加明顯.

HE染色法觀察小鼠肺組織黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移情況, 在200×顯微鏡下觀察小鼠肺組織的病理變化. 結(jié)果如圖3所示, 圖3中黑色箭頭代表B16腫瘤的轉(zhuǎn)移灶, 模型組 (圖3(a)) 肺組織中可見大量黑色轉(zhuǎn)移灶, 平消組 (圖3(b)) 與模型組相比轉(zhuǎn)移灶有所減少. 紫杉醇組 (圖3(c)) 與模型組相比轉(zhuǎn)移灶數(shù)量進一步減少, 且腫瘤面積小于平消單用組. 平消膠囊與紫杉醇聯(lián)用 (圖3(d)) 可明顯減少B16的肺部轉(zhuǎn)移灶, 有效抑制黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移, 并且效果較兩藥單用為優(yōu).

圖2平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對小鼠肺組織B16瘤體生長的影響

Fig.2EffectofPingxiaocapsdecominedwithpoclrtacelonthegrowthofmetastatectumorofB16

圖3平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對B16肺轉(zhuǎn)移的HE染色結(jié)果(×200)

Fig.3 HE stainning result of Pingxiao capsule combination with paclitaxel on the metastatic tumor of B16(×200)

2.4 平消膠囊聯(lián)合紫杉醇可降低小鼠血清中IL-10的含量

酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血漿中IL-10. 結(jié)果如圖4所示, 紫杉醇和平消膠囊單用不能改變小鼠血漿中的IL-10含量, 而250 mg/kg的平消膠囊和30 mg/kg紫杉醇聯(lián)用可明顯降低小鼠血清中IL-10的含量 (P< 0.05,與模型組相比).

圖4平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對動物血清中IL-10的影響

Fig.4 Effect of Pingxiao capsule combination with paclitaxel on the serum content of IL-10

3 討 論

在各類皮膚腫瘤中, 黑色素瘤惡性程度最高, 發(fā)展迅速, 危害人民健康[14].平消膠囊目前已廣泛用于多種惡性腫瘤的協(xié)同治療, 可提高放化療療效, 降低不良反應, 提高患者生存質(zhì)量, 但目前尚未有平消膠囊用于治療黑色素瘤的實驗研究．蔡邵朋等發(fā)現(xiàn),平消膠囊聯(lián)合索拉菲尼可提高中晚期原發(fā)性肝癌患者的近期臨床療效,顯著提高免疫功能恢復,抑制VEGF表達[15]; 房芳等研究發(fā)現(xiàn)平消膠囊聯(lián)合吉非替尼可提高中晚期非小細胞肺癌治療效果, 毒副反應小[16]. 本研究旨在探索平消膠囊與紫杉醇聯(lián)用抑制小鼠黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移的作用.

本研究首先建立了C57BL/6小鼠B16皮下異體移植瘤模型探索平消膠囊聯(lián)合紫杉醇對小鼠黑色素瘤生長的抑制作用. 研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比, 250 mg/kg的平消膠囊和30 mg/kg的紫杉醇單用均能顯著抑制B16瘤體的生長, 抑瘤率分別為25.66%和32.88%, 而兩者聯(lián)合應用抗腫瘤作用增強, 抑瘤率高達62.54%, 腫瘤明顯減小. 隨后, 通過建立B16黑色素瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移模型, 進一步研究了平消膠囊單用及平消膠囊與紫杉醇聯(lián)用對B16黑色素瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的影響. 通過對小鼠肺組織的顯微病理檢查發(fā)現(xiàn), 平消膠囊和紫杉醇單用均能明顯抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移; 與紫杉醇和平消膠囊單用組相比, 平消膠囊聯(lián)合紫衫醇可進一步增強抗腫瘤效果. 同時, 基于小鼠體重變化值可知, 平消膠囊可緩解紫杉醇引起的小鼠體重下降, 這表明平消膠囊可部分緩解紫杉醇的毒副反應.

腫瘤細胞本身可主動分泌抑制性細胞因子, 如VEGF、TGF-β及Th2型細胞因子IL-10、IL-6、IL-4等, 用以調(diào)節(jié)局部免疫細胞的功能. 白細胞介素-10 (Interleukin-10, IL-10) 主要由Th2細胞、單核巨噬細胞和活化B細胞等免疫細胞產(chǎn)生, 可以抑制TNF-α、IL-1、IL-12和IFN-Y等多種細胞因子的分泌[17-19]. IL-10 是一個多功能的細胞因子,具有免疫抑制和血管生成的作用. IL-10對多種免疫細胞如巨噬細胞、Th1細胞、NK細胞等的活性具有抑制作用, 因此IL-10可能和腫瘤的免疫逃逸密切相關[19]. 有研究表明在轉(zhuǎn)移灶中IL-10高于原發(fā)腫瘤, 提示IL-10促進腫瘤轉(zhuǎn)移. IL-10也能活化抑制性T細胞, 從而形成免疫抑制環(huán)境, 進而誘導腫瘤免疫逃逸[20]. 國外研究發(fā)現(xiàn), 彌漫大B細胞淋巴瘤患者血清中IL-6, IL-8和IL-10的水平與臨床病理特征及預后關系密切[21]; IL-10因子-1082A/G多態(tài)性與口腔鱗狀細胞癌風險增加密切相關[22]; IL-10 可通過抑制巨噬細胞功能誘導腫瘤和血管內(nèi)皮細胞增殖從而促進B16黑色素瘤的生長[23]. 因此本研究通過酶聯(lián)免疫法檢測聯(lián)合用藥對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型小鼠血清中IL-10含量的影響. 研究發(fā)現(xiàn), 與模型組相比, 紫杉醇和平消膠囊單用未能有效改變小鼠血清中IL-10的含量, 而紫杉醇和平消膠囊聯(lián)用后血清中IL-10含量明顯下降. 這可能與兩者聯(lián)用后, 通過誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡, 釋放腫瘤抗原, 并進一步增加腫瘤細胞的免疫原性而促進樹突狀細胞 (Dendritic cells, DCs) 提呈抗原和T 細胞活化, 從而使腫瘤細胞的免疫抑制作用減弱, 機體免疫力增強有關[24].

另外, 平消膠囊輔助治療腫瘤可能的相關機制還有:(1)下調(diào)VEGF表達, 抑制腫瘤中新生血管的生成[25]; (2) 抑制黏附分子CD44v6表達, 預防癌細胞轉(zhuǎn)移[26]; (3) 改變高黏高凝血流變性和腸系膜微循環(huán)[27]; (4) 上調(diào)COX相關基因表達[28]; (5) 恢復白細胞低下, 減輕骨髓抑制[29]等. 因為中藥成分較多, 各組分互扶互助, 耐藥性和毒副反應小, 在腫瘤協(xié)同治療中的優(yōu)勢日益顯現(xiàn). 然而, 也是由于成分復雜, 其對信號傳導, 基因表達, 細胞周期及凋亡的作用機制尚不完全明確, 因此, 平消膠囊抗黑色素瘤進一步的作用機制仍是我們未來研究的方向.

4 結(jié) 論

綜上所述, 平消膠囊和紫杉醇聯(lián)合用藥可增強后者的抗腫瘤作用, 并緩解紫杉醇的副作用, 增效的作用機制可能與降低小鼠外周血中IL-10的含量有關. 因此本研究具有較好的臨床用藥參考價值, 為兩種藥物的進一步研究提供一定的理論依據(jù), 也為中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤提供了新思路.