飼料中添加戊糖乳桿菌HC-2對(duì)黃曲霉毒素B1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及酶活性的影響

房 涵, 劉 梅, 王寶杰, 蔣克勇, 王 雷

飼料中添加戊糖乳桿菌HC-2對(duì)黃曲霉毒素B1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及酶活性的影響

房 涵1, 3, 劉 梅1, 2, 4, 王寶杰1, 2, 4, 蔣克勇1, 2, 4, 王 雷1, 2, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 中國(guó)科學(xué)院 海洋大科學(xué)中心, 山東 青島 266071)

為探究飼料中添加戊糖乳桿菌HC-2對(duì)黃曲霉毒素B1(AFB1)刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及肝胰腺酶活性的影響, 將健康的凡納對(duì)蝦(900尾)隨機(jī)分成三組, 分別投喂基礎(chǔ)飼料、添加AFB1(500 μg/kg)飼料以及添加AFB1(500 μg/kg)+戊糖乳桿菌HC-2(5 × 108CFU/g)飼料6周。在試驗(yàn)結(jié)束后, 分別取三組對(duì)蝦的肝胰腺進(jìn)行顯微觀察以及免疫相關(guān)基因和肝胰腺酶活性的測(cè)定。AFB1+HC-2組肝胰腺組織同AFB1組相比損傷程度較輕。同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+HC-2組的肝胰腺免疫基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下調(diào)(<0.05), 且同AFB1組相比, AFB1+HC-2組的免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)的較少(<0.05)。同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+HC-2組的堿性磷酸酶活性(AKP)明顯上升, 且AFB1+HC-2組的AKP活性要高于AFB1組。同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+HC-2組中谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性明顯升高但兩組間無(wú)顯著性差異, 超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性在AFB1組和AFB1+HC-2組間無(wú)顯著性差異, 且三組的總抗氧化能力(T-AOC)無(wú)顯著性差異。研究認(rèn)為飼料中添加戊糖乳桿菌HC-2對(duì)AFB1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)有一定程度的保護(hù)作用, 對(duì)部分免疫基因和堿性磷酸酶活性有顯著影響, 但對(duì)肝胰腺總抗氧化能力沒(méi)有顯著影響。

凡納對(duì)蝦; 戊糖乳桿菌HC-2; 黃曲霉毒素B1; 基因表達(dá); 肝胰腺酶活

我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量位居世界第一, 其中凡納對(duì)蝦()是養(yǎng)殖規(guī)模最大的對(duì)蝦品種。但是在現(xiàn)代高密度集約化養(yǎng)殖過(guò)程中, 水環(huán)境、對(duì)蝦種質(zhì)、飼料品質(zhì)以及病害等多方面因素常常造成對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失。飼料受潮發(fā)霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素是影響飼養(yǎng)生物的生長(zhǎng)和健康的嚴(yán)重危害之一, 其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的危害尤為嚴(yán)重。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的次生代謝產(chǎn)物, 廣泛存在于貯存不當(dāng)?shù)陌l(fā)霉飼料和食品中[1-2]。飼料中的黃曲霉毒素污染, 特別是AFB1的高毒性, 導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益降低, 長(zhǎng)期以來(lái)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)特別關(guān)注的問(wèn)題。

肝胰腺是蝦類消化和免疫系統(tǒng)的主要器官, 根據(jù)對(duì)AFB1致癌作用的研究, 肝胰腺是代謝從外界攝入的AFB1的主要器官。肝胰腺主要功能與消化酶及免疫分子的合成與分泌、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、貯藏和排泄有關(guān)[3]。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖和陸生動(dòng)物中的應(yīng)用, 可以顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物的存活率和生長(zhǎng)性能[4-5], 戊糖乳桿菌HC-2是本實(shí)驗(yàn)室篩選的一株益生菌, 在之前的研究中發(fā)現(xiàn)其具有高黏附性和抗菌活性, 在蝦腸內(nèi)能夠黏附和定殖并競(jìng)爭(zhēng)性地消滅病原弧菌, 促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng), 增強(qiáng)免疫反應(yīng), 保護(hù)對(duì)蝦免受病原體的侵害[6-7]。

目前益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究多集中在其對(duì)養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)性能以及抗菌能力方面, 而益生菌對(duì)受AFB1影響的生物的保護(hù)作用機(jī)制的研究有所欠缺。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已分別對(duì)戊糖乳桿菌HC-2的益生作用以及黃曲霉毒素AFB1對(duì)對(duì)蝦的損傷機(jī)理進(jìn)行了較為深入的研究, 并發(fā)現(xiàn)添加HC-2可顯著降低AFB1導(dǎo)致的對(duì)蝦死亡率。本研究在前期工作基礎(chǔ)上, 探討益生菌在降低黃曲霉毒素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物毒性損傷中的作用機(jī)制。通過(guò)觀察對(duì)肝胰腺顯微結(jié)構(gòu)、分析對(duì)肝胰腺相關(guān)免疫基因表達(dá)及抗氧化酶活性的影響, 從組織、基因表達(dá)及生理層面上探究戊糖乳桿菌HC-2對(duì)在AFB1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺的影響, 為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用、降低黃曲霉毒素對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的損失提供理論依據(jù)和指導(dǎo)策略, 為對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)所用的凡納對(duì)蝦均由青島瑞茲海珍品有限公司提供, 900只健康對(duì)蝦[(6.2±0.3) g]隨機(jī)均分到9個(gè)水族箱(400 L), 分為3組, 所有對(duì)蝦均暫養(yǎng)在鹽度30.5, pH 7.5~8.0, 溫度25~29℃, 溶解氧含量5.4~6.2 mg/L的天然海水中, 持續(xù)通氣, 每日早晚?yè)Q兩次水, 每次換水量為50%, 投喂煙臺(tái)大樂(lè)飼料有限公司生產(chǎn)的凡納對(duì)蝦飼料(42.3%的蛋白質(zhì), 7.2%的脂肪, 11.6%的水和15.5%的灰分)暫養(yǎng)1周。每日在6: 00、13: 00、20: 00進(jìn)行投喂, 每日投喂量為體質(zhì)量的5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料的制備及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)分為3組, 分別是對(duì)照組、AFB1組、AFB1+HC-2組, AFB1組的餌料以基礎(chǔ)飼料添加黃曲霉毒素B1(500 μg/kg), 具體操作: 先將AFB1溶解于氯仿中, 加入魚(yú)油混勻, 后置于37℃水浴中加熱2 h以蒸發(fā)多余的氯仿, 再將含有AFB1的魚(yú)油添加到飼料中。AFB1+HC-2組在AFB1組的基礎(chǔ)上均勻噴灑戊糖乳桿菌HC-2菌懸液, 通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)的戊糖乳桿菌HC-2的濃度, 根據(jù)5 × 108CFU/g濃度計(jì)算添加量, 然后離心后用海水吹懸噴灑在飼料中從而制成菌終濃度為5 × 108CFU/g的含菌飼料, 每周制備一次以保證菌的活力。對(duì)照組飼料在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加同實(shí)驗(yàn)組等量的魚(yú)油。三組飼料在4℃冰箱中貯存。每日在6: 00、13: 00、20: 00投喂, 每日投喂量為體質(zhì)量的5%, 投喂6周后取樣。

1.3 組織切片的制備

將對(duì)蝦的肝胰腺組織放入10%福爾馬林中固定24小時(shí), 在一系列乙醇濃度梯度中脫水(50%~95%), 并嵌入石蠟中。切片后將組織部分(5 μm厚)用蘇木精和伊紅染色, 然后顯微鏡(奧林巴斯CKX41)觀察分析肝胰腺結(jié)構(gòu)。

1.4 基因表達(dá)的測(cè)定

在6周的養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí), 從每個(gè)水族箱中取3只對(duì)蝦, 將肝胰腺分離后取直徑約5 mm的組織分別保存在裝有RNA保護(hù)液的樣品管中, 在4℃箱中保存12小時(shí)后, 移到–80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA提取: 用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (大連寶生物工程有限公司)試劑盒提取肝胰腺組織總RNA, 操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用NanoDrop2000(Thermo)對(duì)所提取RNA進(jìn)行檢測(cè), 用A260/280比測(cè)定RNA的質(zhì)量。

RNA反轉(zhuǎn): 采用TransScript One-Step gDNA Re-moval and cDNA Synthesis Kit試劑盒(全式金生物科技有限公司)進(jìn)行cDNA的合成, 操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件: 42℃維持30 min, 85℃加熱5 min, –80℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR): 采用TransStar Top Green qRT-PCR Supermix(北京全式金生物科技有限公司)試劑盒進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定, 操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究使用的引物如表1所示,基因被用來(lái)作為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)所用的引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1), 用2–ΔΔCt方法來(lái)計(jì)算分析基因的差異表達(dá)水平。

表1 熒光定量PCR分析所用引物及序列

續(xù)表

1.5 抗氧化酶活的測(cè)定

在試驗(yàn)結(jié)束后每個(gè)水族箱分別取3只對(duì)蝦肝胰腺混樣, –80℃冰箱保存, 用于堿性磷酸酶(AKP)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定。操作步驟按照酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素變量方差分析方法(One-Way ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝胰腺組織形態(tài)學(xué)分析

如圖1所示，同對(duì)照組相比, 在AFB1組和AFB1+ HC-2組中對(duì)蝦的肝胰腺出現(xiàn)組織學(xué)改變。在AFB1組中, 肝胰腺的肌上皮層與上皮細(xì)胞有明顯的分離, 部分個(gè)體內(nèi)腔星形多邊形結(jié)構(gòu)消失, 此外, 還出現(xiàn)空泡化細(xì)胞和細(xì)胞溶解。在AFB1+HC-2中, 也有部分細(xì)胞內(nèi)腔星型多邊形結(jié)構(gòu)消失, 肝胰腺肌上皮層與上皮細(xì)胞分離, 但同AFB1組相比, 肝胰腺的損傷程度較輕。

圖1 凡納對(duì)蝦肝胰腺的組織形態(tài)學(xué)分析

注: a: 對(duì)照組; b: AFB1組; c: AFB1+HC-2組。其中BM: 基膜; R: 存儲(chǔ)單元; B: 分泌細(xì)胞; 三角形: 多灶性壞死伴組織丟失

2.2 肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)

如圖2所示, 同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+ HC-2組的肝胰腺免疫基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著下調(diào)。同AFB1組相比, AFB1+HC-2組的免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)的較少, 而兩組的免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異。

圖2 肝胰腺相關(guān)免疫基因Rab、GST、mucin-like PM、Dorsal、Relish、Pro-PO的表達(dá)情況

注: 不同字母代表存在顯著性差異(< 0.05)

2.3 肝胰腺酶活性變化

如圖3所示, 同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+ HC-2組的堿性磷酸酶活性(AKP)明顯上升, 且AFB1+ HC-2組的活性要高于AFB1組。同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+HC-2組中谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性明顯升高, 而超氧化物歧化酶(SOD)活性同對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異, 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性同對(duì)照組相比明顯下降, AFB1組和AFB1+HC-2組無(wú)顯著性差異, 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的總抗氧化能力(T-AOC)沒(méi)有顯著性差異。

圖3 肝胰腺酶活性變化

3 討論

黃曲霉毒素B1在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的影響是較為常見(jiàn)的, AFB1具有強(qiáng)致癌性、致畸性和免疫抑制作用, 往往會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖生物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降, 攝入AFB1污染的食品, 對(duì)人類健康也構(gòu)成潛在威脅[8-9]。目前, 關(guān)于AFB1在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究多集中在AFB1對(duì)養(yǎng)殖生物的毒性作用上, 但對(duì)如何降低AFB1對(duì)養(yǎng)殖生物的危害上研究較少。之前有研究表明, 戊糖乳桿菌HC-2可以在一定程度上增強(qiáng)凡納對(duì)蝦對(duì)病原菌的抵抗力[7], 但戊糖乳桿菌HC-2對(duì)在AFB1刺激下的水產(chǎn)生物是否有保護(hù)作用以及其作用機(jī)理尚未有研究。

肝胰腺是對(duì)蝦主要的免疫器官, 也是黃曲霉毒素B1作用的靶器官, 在以往的研究中發(fā)現(xiàn), 飼喂含AFB1(5 mg/kg)的飼料12天對(duì)凡納對(duì)蝦的肝胰腺組織有嚴(yán)重的損傷作用, 肝胰腺的肌上皮層與上皮細(xì)胞之間存在明顯的分離, 腔內(nèi)的儲(chǔ)存細(xì)胞、分泌細(xì)胞和星形多邊形結(jié)構(gòu)均消失并壞死[10]。Yu等[11]發(fā)現(xiàn)飼喂AFB1(500 μg/kg)的飼料56天后, 凡納對(duì)蝦的肝胰腺分泌細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹、囊泡化, 并且出現(xiàn)大液泡, 線粒體數(shù)量減少的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)AFB1破壞了肝胰腺組織結(jié)構(gòu), AFB1(500 μg/kg)組的凡納對(duì)蝦肝胰腺的肌上皮層與上皮細(xì)胞有明顯的分離, 部分個(gè)體內(nèi)腔星形多邊形結(jié)構(gòu)消失, 此外, 還出現(xiàn)空泡化細(xì)胞和細(xì)胞溶解。在AFB1(500 μg/kg)+HC-2 (5×108CFU/g)組中, 也有部分細(xì)胞內(nèi)腔星型多邊形結(jié)構(gòu)消失, 肝胰腺肌上皮層與上皮細(xì)胞分離, 但損傷程度同AFB1組相比較輕, 說(shuō)明戊糖乳桿菌HC-2在一定程度上減輕了AFB1所致的肝胰腺組織損傷。

Rab蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、真核細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬體形成和成熟等過(guò)程中起重要作用[12]。Wu等[13]證明Rab蛋白可能在蝦對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Wang[10]等研究發(fā)現(xiàn)在飼喂AFB1(5 mg/kg) 后對(duì)蝦的肝胰腺基因表達(dá)上調(diào), 說(shuō)明蝦的免疫系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)激活細(xì)胞吞噬過(guò)程。在本研究中, 同對(duì)照組相比,在AFB1(500 μg/kg)組和AFB1(500 μg/kg)+HC-2(5 × 108CFU/g)組中的表達(dá)量明顯下調(diào), 兩組之間的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異, 與上述文獻(xiàn)研究結(jié)果不同, 推測(cè)可能是由于本研究中投喂AFB1時(shí)間周期較長(zhǎng), 毒素的累積已經(jīng)對(duì)對(duì)蝦免疫系統(tǒng)造成損傷, 從而導(dǎo)致基因表達(dá)量下調(diào)。是一種圍食膜因子, 是腸道化學(xué)屏障的重要組成部分[14]。是IMD通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子, IMD通路是無(wú)脊椎動(dòng)物用來(lái)抵御細(xì)菌和病毒的重要免疫通路[15]。Qi等[16]研究表明, 投喂凡納對(duì)蝦AFB1(15 mg/kg)后,基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在本研究中, 同對(duì)照組相比, 肝胰腺和在AFB1(500 μg/kg)組和AFB1(500 μg/kg)+HC-2(5 × 108CFU/g)組中的表達(dá)量明顯下調(diào), 推測(cè)在長(zhǎng)期投喂AFB1后, 對(duì)蝦的部分免疫功能和IMD免疫通路受到損傷, 所以和表達(dá)量下調(diào)。

是Toll通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子, 在某些特定條件下能夠啟動(dòng)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄[17]。Qi等[16]發(fā)現(xiàn)投喂AFB1(15 mg/kg)后, 凡納對(duì)蝦腸基因被顯著誘導(dǎo), 在第二天和第四天表達(dá)量最高, 并在之后出現(xiàn)回落的趨勢(shì)。在本研究中, 同對(duì)照組相比,基因在AFB1(500 μg/kg)組和AFB1(500μg/kg)+ HC-2(5 × 108CFU/g)組中的表達(dá)量皆明顯下調(diào), 但相比較于AFB1+HC-2組, AFB1組的下調(diào)量較大, 推測(cè)在長(zhǎng)期投喂AFB1后凡納對(duì)蝦的免疫通路Toll受到損傷, 因此基因表達(dá)量下調(diào), 同時(shí)戊糖乳桿菌HC-2的添加對(duì)免疫通路Toll在一定程度上起到了保護(hù)作用。酚氧化酶原(Pro-PO)系統(tǒng)是一種包括模式識(shí)別蛋白、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、酚氧化酶原等在內(nèi)的酚化級(jí)聯(lián)反應(yīng)[18], 是甲殼動(dòng)物的重要免疫防御系統(tǒng), 在本研究中,基因基因在AFB1(500 μg/kg)組和AFB1(500 μg/kg)+HC-2(5×108CFU/g)組中的表達(dá)量皆明顯下調(diào), 但相比較于AFB1+HC-2組, AFB1組的下調(diào)量較大, 推測(cè)在長(zhǎng)期投喂AFB1后凡納對(duì)蝦的酚氧化酶原系統(tǒng)受到損傷, 因此基因表達(dá)量下調(diào), 同時(shí)戊糖乳桿菌HC-2的添加對(duì)酚氧化酶原系統(tǒng)在一定程度上起到了保護(hù)作用。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷, 在長(zhǎng)期投喂AFB1后, 凡納對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)受到了一定程度的損傷, 戊糖乳桿菌HC-2的添加對(duì)Toll通路和酚氧化酶原系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用, 從而在一定程度上保護(hù)了對(duì)蝦的肝胰腺組織。

機(jī)體的抗氧化能力依賴于機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng), 當(dāng)機(jī)體接觸AFB1時(shí), 在有氧代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)的過(guò)表達(dá), 造成氧化損傷, 氧化裂解是甲殼動(dòng)物對(duì)抗產(chǎn)生大量ROS的入侵生物的重要防御機(jī)制, 活性氧在宿主防御中發(fā)揮重要作用[19], 但過(guò)量產(chǎn)生活性氧和殘留活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重?fù)p害, 為了保護(hù)自身免受ROS的傷害, 細(xì)胞已經(jīng)形成了一套抗氧化防御系統(tǒng), 幾種重要的抗氧化酶包括SOD、CAT和GST等在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和預(yù)防或修復(fù)氧化損傷方面具有重要作用[20-21]。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)投喂凡納對(duì)蝦AFB1(5 mg/kg)30天內(nèi), 同對(duì)照組相比, 肝胰腺SOD、CAT和GST酶活性皆明顯上升, 總體呈先上升后下降趨勢(shì), 原因可能是AFB1引發(fā)了凡納對(duì)蝦的抗氧化防御系統(tǒng), 但隨著AFB1的長(zhǎng)期投喂引起了抗氧化系統(tǒng)的損傷。在本研究中, 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的SOD、T-AOC活性無(wú)顯著性差異, 同對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組CAT活性降低, 且AFB1組和AFB1+HC-2組CAT活性無(wú)顯著性差異, AFB1組和AFB1+HC-2組的GST活性相較于對(duì)照組上升, 且兩組間無(wú)顯著性差異, 推測(cè)原因是AFB1激發(fā)GST抗氧化系統(tǒng), 使得GST活性升高, 同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加, 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度超過(guò)CAT的清除能力時(shí), CAT的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚苑€(wěn)定狀態(tài), 酶活性逐漸降低[23], 且戊糖乳桿菌HC-2的添加沒(méi)有對(duì)受AFB1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺總抗氧化能力產(chǎn)生明顯影響。堿性磷酸酶(AKP)是一種在堿性環(huán)境中催化磷酸酯水解, 參與轉(zhuǎn)移磷酸集團(tuán), 同時(shí)作為動(dòng)物溶酶體的重要組分, 在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。當(dāng)病毒感染對(duì)蝦組織細(xì)胞后, 胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)膨大擴(kuò)張甚至斷裂, AKP陽(yáng)性顆粒和AKP陽(yáng)性反應(yīng)的髓樣小體在細(xì)胞質(zhì)中被檢測(cè)到[25]。何亞男等[26]研究表明, 半乳甘露寡糖、半乳甘露寡糖+乳酸菌能顯著增加大鼠十二指腸及腸黏膜內(nèi)AKP的活性, 堿性磷酸酶活性的增強(qiáng)表明小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收功能的增強(qiáng)。在本研究中, 同對(duì)照組相比, AFB1組和AFB1+HC-2組的堿性磷酸酶(AKP)活性明顯升高, 且AFB1+HC-2組的活性要明顯高于AFB1組, 推測(cè)原因可能是AFB1感染對(duì)蝦后引發(fā)肝胰腺細(xì)胞免疫反應(yīng)從而導(dǎo)致AKP活性升高, 同時(shí)戊糖乳桿菌HC-2的添加也增加了AKP的活性, 反映出戊糖乳桿菌HC-2可能主要通過(guò)激活免疫反應(yīng)保護(hù)凡納對(duì)蝦的肝胰腺。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次探究在飼料中添加戊糖乳桿菌HC-2對(duì)在AFB1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺組織、免疫基因及肝胰腺酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 戊糖乳桿菌HC-2對(duì)在AFB1刺激下的凡納對(duì)蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)具有一定程度的保護(hù)作用, 并對(duì)某些免疫相關(guān)通路的基因進(jìn)行調(diào)控, 對(duì)肝胰腺總抗氧化能力沒(méi)有明顯影響, 但對(duì)肝胰腺堿性磷酸酶活性有顯著影響。由此推斷: (1) 戊糖乳桿菌HC-2降低黃曲霉毒素AFB1對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦的毒害作用與其對(duì)肝胰腺的保護(hù)作用相關(guān)。(2) 該保護(hù)作用主要通過(guò)激活或保護(hù)肝胰腺的免疫應(yīng)答而非抗氧化機(jī)能實(shí)現(xiàn)。本研究的結(jié)果為利用益生菌降低飼料及原料中AFB1對(duì)對(duì)蝦的危害提供理論依據(jù)。

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Effects ofHC-2 on the morphology of hepatopancreas, immunity-related genes, and enzyme activity ofaffected by aflatoxin B1

FANG Han1, 3, LIU Mei1, 2, 4, WANG Bao-jie1, 2, 4, JIANG Ke-yong1, 2, 4, WANG Lei1, 2, 4

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

To explore effects ofHC-2 on the hepatopancreas morphology, immune-related genes, and enzyme activity ofaffected by aflatoxin B1 (AFB1), shrimps were fed with formulated feeds containing AFB1 (500 μg/kg), AFB1 (500 μg/kg) +HC-2 (5 × 108CFU/g), and a basal commercial diet (control group) respectively. At the end of the experiment, the morphology of the hepatopancreas, expression of immune-related genes, and activity of hepatopancreas enzymes were detected. The hepatopancreas morphology of the AFB1 +HC-2 group suffered less damage than that of the AFB1 group. The relative expression of immune-related genes (Rab, glutathione S-transferase [GST], mucin-like PM, Dorsal, Relish, and Pro – PO) in the AFB1 and AFB1 + HC-2 groups was significantly lower than in the control group (<0.05), and the relative expression of immune-related genes (GST, Dorsal, and Pro – PO) in the AFB1+HC-2 group was higher than in the AFB1 group (<0.05). The activity of alkaline phosphatase (AKP) increased significantly in the AFB1 and AFB1+HC-2 groups compared with that in the control group, and the activity of AKP in the AFB1+HC-2 group was higher than in the AFB1 group. The activity of GST increased in the AFB1 and AFB1+HC-2 groups compared with that in the control group, and there was no significant difference in the AFB1+HC-2 and AFB1 groups. The activity of superoxide dismutase and catalase has no significant difference between the AFB1 and AFB1+HC-2 groups, and the total antioxidant capacity (T-AOC) has no significant difference between the control and experimental groups. We concluded thatHC-2 had a positive effect on the hepatopancreas structure of shrimps stimulated by AFB1 and induced a significant effect on some immune genes and AKP activity but had no significant effect on the T-AOC of the hepatopancreas.

HC-2aflatoxin B1; gene expression; enzyme activity of hepatopancreas

Mar. 12, 2020

S968.22

A

1000-3096(2020)11-0065-07

10.11759/hykx20200312002

2020-03-12;

2020-03-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2019YFD0900401)；山東省重大科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)課題(2018SDKKJ0502-2)

[Supported by National Key R&D Program of China, No. 2019YFD0900401; Major Scientific and Technological Innovation Project, Shandong Province, China, No. 2018SDKJ0502-2]

房涵(1994-)，女，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控的研究，電話：0532-82898723，E-mail：fanghana163@ 163.com；王雷(1966-)，通信作者，E-mail：leiwang@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)