口腔鱗狀細(xì)胞癌表面增強(qiáng)拉曼光譜的納米探針構(gòu)建及應(yīng)用研究

閆 冰 薛麗麗 關(guān)麗梅 張炳煌 駱獻(xiàn)陽(yáng)▲

1.廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，福建廈門(mén) 361003；2.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門(mén) 361003；3.廈門(mén)市耳鼻咽喉頭頸外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361003；4.廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，福建廈門(mén) 361003

口腔癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，在全身惡性腫瘤發(fā)病率排名第十二名，而在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率排名第八名。在我國(guó)，口腔癌發(fā)病率也呈逐年升高的趨勢(shì)[1-3]?？谇话┑牟±眍?lèi)型主要是口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌，雖然隨著科技進(jìn)步，口腔癌的治療方法及藥物不斷更新，但其預(yù)后依然較差，5 年存活率僅為50%～60%[3]。早期診斷、早期治療依然是改善口腔癌患者預(yù)后的最有效方法，其中治療方式以外科手術(shù)切除腫瘤及頸部淋巴結(jié)為主，術(shù)中手術(shù)切緣是否有腫瘤殘留對(duì)患者的預(yù)后至關(guān)重要。

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）基于電磁場(chǎng)增強(qiáng)和電荷轉(zhuǎn)移增強(qiáng)的拉曼光譜新技術(shù)，其原理是將納米級(jí)探針加入在待測(cè)樣本中進(jìn)行混合，納米探針在待測(cè)樣本表面近距離接觸時(shí)可以增強(qiáng)局域電磁場(chǎng)，提高了待測(cè)樣本分子拉曼散射的概率，從而指數(shù)級(jí)地提高待測(cè)樣本拉曼信號(hào)強(qiáng)度[4-5]。SERS 具有快速、便捷、無(wú)創(chuàng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)靈敏度高，單個(gè)分子樣本也可被檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，如疾病檢測(cè)及診斷[6]。

研究表明，口腔黏膜癌前病變時(shí)期表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor recptor， EGFR）表達(dá)即開(kāi)始增強(qiáng)，EGFR 主要在上皮細(xì)胞表達(dá)，在癌變過(guò)程中鱗狀上皮細(xì)胞EGFR 表達(dá)水平不斷增高[7-8]。因此，本研究構(gòu)建一種EGFR 抗體修飾的納米探針并將其應(yīng)用于口腔鱗狀細(xì)胞癌SERS 的檢測(cè)研究中。

1 材料和方法

1.1 EGFR抗體修飾的納米探針制備

在容量瓶中配置100mL 1.0×10-4g/mL 氯金酸水溶液，加入至250mL 圓底燒瓶中。在快速攪拌下將溶液加熱至沸騰，迅速一次性加入0.95mL 1.0×10-2g/mL 的檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)攪拌沸騰30min 后冷卻。然后取該溶液10mL，緩慢滴加100μL 0.1mM的4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid， 4-MBA）溶液并不斷攪拌，充分?jǐn)嚢杌旌?0min 后靜置過(guò)夜，再以6000r/min 離心10min，去除上清液，去離子水重懸即可使用。取上述10mL Au-MBA 粒子，在攪拌下緩慢滴加550μL 0.2mM的α-巰基-ω 羧基聚乙二醇（α- mercapto -ωcarboxyl polyethylene glycol， PEG）溶液，調(diào)整PEG的濃度為20μM，充分?jǐn)嚢杌旌?0min 后靜置過(guò)夜后，6000r/min 離心10min，去除上清液，去離子水重懸即可使用。取上述溶液10mL，加入0.5mM 的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1- （3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC] 和N- 羥 基 琥 珀 酰 亞 胺（Nhydroxysuccinimide， NHS）溶液各10μL，混合攪拌30min 后離心，將剩余的EDC 和NHS 去除，加入EGFR 抗體2μL，混合攪拌30min 后保存于4℃冰箱中即可使用。生成MBA、PEG 及EGFR 抗體修飾的納米級(jí)金顆粒。

1.2 探針性能檢測(cè)

應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜儀（Renisha 公司，英國(guó)）對(duì)不同粒子進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。應(yīng)用VancourRaman Algorithm 軟件[9]去除光譜熒光信號(hào)及噪聲，平滑光譜。應(yīng)用Oringin 8.0（Oringin 公司，美國(guó)）軟件繪制不同粒子光譜進(jìn)行比較。應(yīng)用S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測(cè)不同粒子形態(tài)。應(yīng)用Cary5000 紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)（安捷倫公司，中國(guó)）檢測(cè)不同粒子的吸收光譜，反應(yīng)粒子表面變化，進(jìn)而提示粒子表面被不同分子修飾。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGFR 抗體修飾的納米探針細(xì)胞毒性。取1mL 原液，3000r 離心10min 后去上清液，加入1mL 細(xì)胞培養(yǎng)基，超聲震蕩溶解，再添加9mL 培養(yǎng)基將納米探針濃度調(diào)整為1nmol/L，作為檢測(cè)的基準(zhǔn)濃度分別加入到SCC-4 細(xì)胞，Tca8113細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察細(xì)胞凋亡情況，無(wú)納米探針加入的細(xì)胞組作為對(duì)照組。

1.3 口腔鱗癌腫瘤組織SERS成像研究

本研究選取無(wú)免疫裸鼠皮下接種舌鱗癌細(xì)胞SCC-4、Tca8113 及纖維肉瘤細(xì)胞HT1080。每個(gè)細(xì)胞系選取8 只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，SCC-4 和Tca8113 作為實(shí)驗(yàn)組，HT1080 作為對(duì)照組。待小鼠腫瘤直徑達(dá)1cm 左右時(shí)，將濃度為1.2×10-7μmol/mL （7.3×1010個(gè)/mL）的納米粒子混懸液200μL 多點(diǎn)注射至腫瘤內(nèi)24h 后處死小鼠，將腫瘤完整剝離后，應(yīng)用Leica切片機(jī)（Leica 公司，德國(guó)）將腫瘤組織進(jìn)切片，切片厚度約10μm，連續(xù)進(jìn)行組織切片，將其中一張組織切片貼附于定制鋁片上，進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，而將另外一張組織切片貼附于載玻片上并進(jìn)行HE 染色。通過(guò)與HE 切片進(jìn)行位置比對(duì)后，確定鋁片上拉曼光譜檢測(cè)部位，應(yīng)用Nanophoton Raman-11（Nanophoto公司，日本）激光顯微共聚焦拉曼光譜儀檢測(cè)。檢測(cè)條件：激發(fā)光波長(zhǎng)785nm，線(xiàn)性?huà)呙?，激發(fā)功率10mW，掃描時(shí)間10s，光柵設(shè)定為600/mm，累及2 次。應(yīng)用Raman imager（Nanophoto 公司，日本）軟件繪制組織拉曼光譜圖。

2 結(jié)果

2.1 納米探針制備及性能檢測(cè)結(jié)果

本研究中經(jīng)過(guò)氧化還原方法制備的Au 納米粒子，其濃度約10nmol/L，直徑約55nm，類(lèi)圓形顆粒，大小心態(tài)均一，性狀穩(wěn)定，可以常溫下保存5 ～7d（圖1）。納米粒子及EGFR 抗體修飾后的納米探針掃描電鏡可見(jiàn)，單純Au 納米粒子容易出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，但隨著MBA、PEG 以及EGFR 抗體加入后，修飾納米粒子表面，其團(tuán)聚現(xiàn)象得到改善。同時(shí)在納米Au 粒子表面形成一層高分子修飾膜，表明MBA、PEG 以及EGFR 抗體成功修飾Au 粒子表面（圖1）。

圖1 納米Au 粒子及MBA、PEG 及EGFR抗體修飾的納米探針的掃面電鏡

本研究中，采用EDC 和NHS 活化PEG 的羧基端使其更好地與EGFR 抗體的氨基端相結(jié)合。不同粒子的紫外可見(jiàn)光吸收光譜同樣提示通過(guò)不同分子修飾后粒子表面性狀改變（圖2）。對(duì)不同粒子進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，結(jié)果提示單純Au 粒子無(wú)拉曼活性，但經(jīng)過(guò)MBA 拉曼活性分子修飾后，可見(jiàn)明顯的拉曼信號(hào)1073/cm 和1589/cm。而后經(jīng)過(guò)PEG修飾后，拉曼信號(hào)無(wú)明顯變化，表明PEG 無(wú)明顯拉曼活性，不會(huì)影響MBA 拉曼信號(hào)。最后在粒子表面加入EGFR 抗體修飾，經(jīng)過(guò)修飾后，可見(jiàn)其拉曼光譜中主要拉曼信號(hào)仍為1073/cm 和1589/cm，但可見(jiàn)1004/cm 和1543/cm，表面納米粒子表面存在蛋白質(zhì)類(lèi)生物分子結(jié)構(gòu)，這也從光譜檢測(cè)方面驗(yàn)證了EGFR 抗體已修飾在Au 粒子表面（圖2）。同時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)過(guò)MBA、PEG 及EGFR 抗體修飾的納米探針對(duì)細(xì)胞凋亡率也無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖3 及表1。流式細(xì)胞儀結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞周期無(wú)明顯差異，表明納米探針對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

圖2 納米Au 粒子及MBA、PEG、EGFR 抗體修飾納米粒子表面不同階段的拉曼光譜及吸收光譜

圖3 不同組細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

表1 三種細(xì)胞經(jīng)過(guò)納米探針處理24h后的細(xì)胞凋亡比例（%）

2.2 納米探針應(yīng)用于口腔鱗狀細(xì)胞癌組織的SERS成像研究

HE 切片采用多個(gè)部位連續(xù)切片進(jìn)行觀察。完成封片后進(jìn)行鏡檢拍照，可見(jiàn)石蠟切片HE 染色的部分切片組織細(xì)胞核空洞，各組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但Tca8113、SCC-4 組織內(nèi)可見(jiàn)局部納米粒子聚集，而HT1080 腫瘤組織內(nèi)未見(jiàn)明顯納米粒子聚集。Tca8113、SCC-4 鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞EGFR高表達(dá)，而HT1080 為人成纖維肉瘤細(xì)胞，EGFR 表達(dá)較低，因此該結(jié)果提示經(jīng)過(guò)修飾后的納米粒子對(duì)EGFR 高表達(dá)的腫瘤組織具有一定的特異性，傾向聚集于腫瘤細(xì)胞EGFR 高表達(dá)的腫瘤組織，而肉瘤細(xì)胞HT1080 腫瘤組織內(nèi)無(wú)明顯納米粒子聚集（圖4）。應(yīng)用Nanophoton Raman-11 激光顯微共聚焦拉曼光譜儀檢測(cè)對(duì)SCC-4、Tca8113 及HT1080 腫瘤組織進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，以納米探針上MBA 拉曼活性信號(hào)1073/cm 作為特征譜峰，繪制腫瘤組織的拉曼光譜圖像。如圖5 所示，鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)1073/cm（圖中白色亮點(diǎn)），而肉瘤腫瘤組織內(nèi)未見(jiàn)明顯增強(qiáng)拉曼信號(hào)。這表明合成納米粒子具有一定的選擇性，可以用于鱗狀細(xì)胞癌的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)研究。該結(jié)果提示經(jīng)過(guò)MBA-PEG-EGFR 抗體修飾的納米級(jí)金顆粒可以用于EGFR 高表達(dá)的腫瘤組織篩查，為臨床上檢測(cè)EGFR 高表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織提供了理論依據(jù)。

圖4 小鼠成瘤組織HE 切片

圖5 小鼠成瘤組織的拉曼光譜圖像

3 討論

隨著激光技術(shù)及儀器的發(fā)展，光譜技術(shù)在惡性腫瘤的診斷及檢測(cè)被廣泛應(yīng)用，如紅外光譜檢測(cè)、組織熒光檢測(cè)、拉曼光譜檢測(cè)等技術(shù)，這些技術(shù)的應(yīng)用為惡性腫瘤的診斷提供了一種實(shí)時(shí)、便捷、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)的新方法[10]。在眾多的光譜診斷技術(shù)中，拉曼光譜技術(shù)成為近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)技術(shù)，其原理是分子振動(dòng)引起入射光與散射光頻率的差異來(lái)反映樣本分子結(jié)構(gòu)及組成等信息，靈敏性高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)樣本無(wú)需處理、普適性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[11-14]。在檢測(cè)生物樣本的研究中，拉曼光譜技術(shù)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，譜峰分辨率高，可以檢測(cè)液體樣本、快速成像等，適用于臨床疾病組織樣本研究[15]。拉曼光譜對(duì)樣本條件要求較低，無(wú)需預(yù)處理，同時(shí)光譜信息豐富，可獲得樣本內(nèi)細(xì)胞、組織或體液分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)組成的信息，可以檢測(cè)磷脂、DNA、多肽等物質(zhì)成分組成及分子結(jié)構(gòu)信息，有“分子指紋”技術(shù)之稱(chēng)[15-16]。基于拉曼光譜的上述優(yōu)點(diǎn)，拉曼光譜技術(shù)被應(yīng)用于檢測(cè)口腔癌的研究，獲得良好的結(jié)果，平均診斷準(zhǔn)確率高達(dá)90%以上[17-18]。

本研究在應(yīng)用SERS 檢測(cè)技術(shù)中引入拉曼活性分子MBA、高分子PEG 及EGFR 抗體來(lái)修飾納米粒子表面。應(yīng)用生物親和性高分子PEG 修飾納米級(jí)探針，其巰基可以與納米探針表層結(jié)合，為納米提供了良好的空間穩(wěn)定性，同時(shí)羧基為EGFR 抗體標(biāo)記提供了良好的位點(diǎn)[19-20]。此外，在納米粒子表面引入拉曼活性分子MBA 作為示蹤劑用于標(biāo)記納米探針，從而制備出一種能準(zhǔn)確檢測(cè)舌鱗狀細(xì)胞癌分子邊界的特異性SERE 探針。PEG 作為修飾探針表層的高分子，其長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)既可以為探針提供良好的空間穩(wěn)定性及生物親和性能，長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的空間位阻又可以保護(hù)作為拉曼示蹤標(biāo)記的MBA。PEG上的羧基經(jīng)過(guò)活化劑活化后與EGFR 抗體表面的氨基相結(jié)合，從而使納米探針具備檢測(cè)腫瘤組織中EGFR 表達(dá)的特異性探針[21]。

EGFR 是一種酪氨酸激酶型跨膜受體，通過(guò)與配體結(jié)合導(dǎo)致EGFR 之間二聚化，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域，啟動(dòng)下游細(xì)胞信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，有助于細(xì)胞增殖和促進(jìn)血管新生，與惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能有關(guān)[22-25]。有研究顯示，在無(wú)糜爛性和潰瘍性病變的口腔扁平苔蘚標(biāo)本中，EGFR 表達(dá)較弱，而在糜爛性和潰瘍性病變的扁平苔蘚標(biāo)本、鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤標(biāo)本及鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中EGFR 的陽(yáng)性率分別為20%、25%和60%，表明EGFR 在從扁平苔蘚到口腔鱗狀細(xì)胞癌的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中表達(dá)不斷增加。Khan 等[24]對(duì)97 例口腔鱗癌組織標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)EGFR 蛋白表達(dá)高達(dá)92.8%。Huang 等[25]在對(duì)194 例口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后較差，主要體現(xiàn)為較短的無(wú)瘤生存期，這與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此EGFR 過(guò)表達(dá)可以作為口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)EGFR 的特異性納米探針，應(yīng)用SERS 技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)出鱗狀細(xì)胞癌組織內(nèi)EGFR 表達(dá)情況，繪制出腫瘤組織EGFR 表達(dá)的拉曼圖像，為臨床提供一種快速、便捷、準(zhǔn)確、可視化的腫瘤組織EGFR 表達(dá)的檢測(cè)新方法，為臨床上應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切緣EGFR 的表達(dá)情況、評(píng)估患者預(yù)后、早期診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌等提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持，進(jìn)一步促進(jìn)口腔癌早期診斷、術(shù)中檢測(cè)及預(yù)后評(píng)估等技術(shù)的發(fā)展，提高口腔癌患者生活質(zhì)量及預(yù)后。