全程氨氧化菌的發(fā)現(xiàn)及其進展研究

史毓文

摘 要：一百年以來，兩段式硝化理論即氨氮先被氨氧化菌氧化為亞硝酸鹽氮進而再被亞硝酸鹽氧化菌氧化為硝酸鹽氮得到了普遍認可。2015年，一種能夠?qū)钡隗w內(nèi)直接轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮的全程氨氧化細菌（COMAMMOX）被人們發(fā)現(xiàn)，打破了傳統(tǒng)的認知?，F(xiàn)今，對COMAMMOX這種新的脫氮功能細菌已有較多的研究。對全程氨氧化作用的機理以及COMAMMOX細菌的發(fā)現(xiàn)、分布以及代謝特征進行了綜述，結(jié)合現(xiàn)今的研究成果，也對COMAMMOX菌的工程應(yīng)用提出了三個可能的應(yīng)用方向：污水處理水廠出水的深度處理;減少N2O氣體的排放;富營養(yǎng)化水體的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：硝化過程;硝化細菌;全程氨氧化細菌;氮循環(huán)

中圖分類號：TB 文獻標識碼：Adoi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2020.02.094

氮元素是組成蛋白質(zhì)、維持生命體結(jié)構(gòu)和功能的重要營養(yǎng)元素。氮的生物化學(xué)循環(huán)是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的核心之一，主要是由微生物所驅(qū)動。其中，微生物參與的重要的氮循環(huán)環(huán)節(jié)有4個：固氮作用，硝化作用，反硝化作用和礦化作用。生物硝化作用是推動還原態(tài)氮（NH4+-N）向氧化態(tài)氮（NO2--N與NO3--N）轉(zhuǎn)化的過程，是氮循環(huán)的關(guān)鍵過程，對維持氮素平衡具有重要的意義。俄國微生物學(xué)家Winogradsky于1890最早發(fā)現(xiàn)和分離了兩種氨氧化微生物，并在此基礎(chǔ)上提出NH4+-N的兩步硝化理論：第一步由氨氧化菌（AOB）將NH4+-N氧化為NO2--N;第二步，由亞硝酸鹽氧化菌（NOB）將NO2--N氧化為NO3--N。然而2004年，Venter等人在science上發(fā)表論文發(fā)現(xiàn)存在著氨氧化古菌（AOA）也能完成NH4+-N氧化為NO2--N的這一過程。

該理論一百多年來，受到了學(xué)術(shù)界的廣泛認可。人們對硝化過程的研究多集中在氨氧化微生物上，這是因為：氨氧化一直被認為是硝化的限速步驟;AOA的發(fā)現(xiàn)引起了研究者們的關(guān)注并進行了大量的研究，如土壤以及水生系統(tǒng)等環(huán)境樣品中的種群結(jié)構(gòu)與分布;還有就是，NOB被認為中一種專性的化能自養(yǎng)細菌，生理特性較為單一。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，屬于NOB的亞硝化螺菌屬的部分微生物可以直接將NH4+-N在體內(nèi)氧化為NO3--N，該微生物被稱作為全程氨氧化微生物（COMAMMOX）。

COMAMMOX的發(fā)現(xiàn)以及其獨特的完全氨氧化過程即能將NH4+-N直接氧化為NO3--N的微生物過程給傳統(tǒng)的兩步硝化理論造成了很大的沖擊，引起了研究者關(guān)于硝化作用的諸多思考，如：由于COMAMMOX的存在，AOB以及NOB的生物活性是否被高估了？COMAMMOX對自然界NH4+-N氧化的貢獻為多少？COMAMMOX在自然環(huán)境的生態(tài)位點是什么？了解COMAMMOX相關(guān)的以上問題對于正確認識生物硝化過程以及氮素的自然循環(huán)途徑有著重要意義，本文將對全程氨氧化作用的機理以及COMAMMOX細菌的發(fā)現(xiàn)、分布以及代謝特征相關(guān)研究進展進行綜述。

1 全程氨氧化作用與COMAMMOX細菌

傳統(tǒng)的NH4+-N硝化過程是通過AOB以及NOB兩種微生物先后催化完成的，如圖1中的途徑1所示。在第一步中，能夠進行NH4+-N氧化作用的微生物還有AOA，在它們的氨單加氧酶（AMO）以及羥胺脫氫酶（HAO）參與下，NH4+-N被催化氧化成NO2--N;第二步中，在NOB中的亞硝鹽氧化還原酶（NXR）參與下，NO2--N被催化氧化成NO3--N[14]。COMAMMOX菌中由于存在著氨氧化的全部的酶，能夠發(fā)生將NH4+-N氧化為NO3--N的全程硝化過程。在熱力學(xué)角度來說這個反應(yīng)是完全可行的，如公式（1）和（2）所示：傳統(tǒng)的硝化過程產(chǎn)生的標準吉布斯自由能變分別為ΔG°′=-274.7 kJ/mol和ΔG°′=-74.1 kJ/mol，而若一種微生物體內(nèi)完成NH4+-N催化氧化成NO3--N的過程將獲得更多的能量ΔG°′=-378.9 kJ/mol（如公式3所示）。所以理論上，能夠?qū)崿F(xiàn)全程氨化反應(yīng)的COMAMMOX能從單位摩爾質(zhì)量的NH4+-N中獲得更多的能量，因此，Costa等人早在2006年就預(yù)測COMAMMOX在自然界中一定可以存在，COMAMMOX與AOB與NOB相比，生長速率可能較低。并且，我國學(xué)者鄭平等人1999年就認為氧化NH4+-N這種基質(zhì)產(chǎn)生的能量不高，理論上更利于一種微生物生長而不是兩種微生物（AOB與NOB）。

2 COMAMMOX的發(fā)現(xiàn)

雖然科學(xué)家對完全氨氧化菌的存在一直深信不疑，但直到2015年11月，van Kessel等人《nature》發(fā)表了名為“Complete nitrification by a single microorganism”的文章，才正式的確認了自然界中有COMAMMOX菌的存在。van Kessel等人在一個水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的厭氧滴濾池中取得生物樣品，接種在厭氧反應(yīng)器中并使用較低濃度的NH4+-N、NO2--N、NO3--N培養(yǎng)了12個月，得到了脫氮功能菌的富集物;這些富集物表現(xiàn)出了良好的厭氧氨氧化活性，即能在厭氧條件下將NH4+-N和NO2--N同時生成N2;通過原位熒光分子雜交技術(shù)（Fish）對富集物進行研究，發(fā)現(xiàn)富集物中存在45%的厭氧氨氧化菌，但還發(fā)現(xiàn)存在15%的疑似Nitrospira屬的亞硝酸鹽氧化菌;通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，疑似Nitrospira屬的亞硝酸鹽氧化菌為兩種 （Nitrospira sp.1 and sp.2），兩種細菌細胞內(nèi)均存在著NH4+-N氧化過程的相關(guān)酶AMO與HAO，以及NO2--N氧化過程相關(guān)的酶NXR，在基因水平上，Nitrospira sp.1 and sp.2均具有全程氨氧化潛力。為證明這一點，van Kessel等人用15N標記的NH4+-N來繼續(xù)培養(yǎng)富集物，發(fā)現(xiàn)富集物中除了厭氧氨氧化菌生成的29N2，還有30N2的出現(xiàn)，這些30N2一定是Nitrospira sp.1 and sp.2將15N標記的NH4+-N氧化為15N標記的NO2--N，然后再由厭氧氨氧化代謝生成的。由此，就證實了原來是亞硝酸鹽氧化菌的Nitrospira sp.1 and sp.2也有氨氧化的能力，是一種全程氨氧化微生物。

與此同時，Daims等人在俄羅斯北高加索的Aushiger地區(qū)的一個深約1200 m的石油勘探井的一段熱水管上采集了生物膜樣品，然后在46℃條件下用含NH4+-N的礦物培養(yǎng)基對生物膜進行培養(yǎng)，以得到高溫氨氧化微生物;然而，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)了該培養(yǎng)物能夠?qū)钡耆趸癁橄跛猁};對培養(yǎng)物進行分離，最后得到了一種完全氨氧化微生物，Candidatus Nitrospira inopinata，它也含有與氨氧化過程相關(guān)的全部基因。這些關(guān)于COMAMMOX的發(fā)現(xiàn)，打破了傳承100多年的傳統(tǒng)硝化理論，使人們重新認識自然界的氮循環(huán)過程。

3 COMAMMOX在各生態(tài)系統(tǒng)中的分布

研究者發(fā)現(xiàn)COMAMMOX在自然生態(tài)系統(tǒng)中分布較為廣泛。自然界中，COMAMMOX主要分布諸如森林土壤和水稻田等土壤環(huán)境，河流、湖泊和濕地等淡水環(huán)境以及它們的底泥和沉積物當(dāng)中。然而，作為生命起源的海洋生態(tài)系統(tǒng)中，卻尚未發(fā)現(xiàn)COMAMMOX的存在。

HU等人對來自中國各地的pH不同的300個土壤樣品進行實時定量基因擴增熒光檢測分析（qPCR），研究各土壤群落中COMAMMOX以及“半程氨氧化菌”AOB、AOA、NOB之間的相對豐度。結(jié)果表明，COMAMMOX在各土壤樣品中廣泛存在且數(shù)量眾多，且在貧營養(yǎng)條件下比AOB、AOA、NOB更具有競爭力。萬琪慧等人采集了重慶市北碚區(qū)冬水稻田5、10、20、40 cm深度處土壤樣品，利用qPCR技術(shù)分析了土壤中“半程氨氧化菌”AOB、AOA、NOB和COMAMMOX在土壤中垂直方向上的豐度變化規(guī)律，研究結(jié)果表明：COMAMMOX在不同深度水稻土層中廣泛存在，且數(shù)量遠超“半程氨氧化菌”;并且發(fā)現(xiàn)COMAMMOX隨著采樣深度的增加豐度越來越高，這個結(jié)果也表明了COMAMMOX是一種可在貧營養(yǎng)條件下良好生長的微生物。

余晨笛等人從長江口潮灘沉積物中取得樣品并進行了富集，發(fā)現(xiàn)富集物種有四類硝化菌群COMAMMOX、AOB、AOA以及NOB，其相對豐度分別為48%，50%，2%和0.1%，證明了長江口潮灘中存在著大量的COMMAMOX菌群;利用宏基因組轉(zhuǎn)錄技術(shù)分析四類硝化細菌的基因表達，結(jié)果表明COMAMMOX的基因表達活性最強，具有很高的代謝活性;又利用qPCR技術(shù)分析河口沉積物，湖泊以及河流沉積中COMAMMOX的群落多樣性，最終發(fā)現(xiàn)河口，潮灘以及近海的COMAMMOX群落組成將近，而不同于湖泊，河流等沉積物的COMAMMOX群落。

在人工強化的生態(tài)系統(tǒng)，例如污水處理廠中也發(fā)現(xiàn)了COMAMMOX的存在。Daims等人研究指出在維也納的污水處理系統(tǒng)中的COMAMMOX菌占到了全部硝化螺菌數(shù)量的73%-71%，比傳統(tǒng)的AOB相比，也有較高的豐度。Chao等人從香港某好氧污水處理設(shè)施中取樣并通過宏基因組技術(shù)對其中的脫氮細菌進行分析，結(jié)果表明樣品中存在兩種amoA基因與已發(fā)現(xiàn)的COMAMMOX菌Ca. N.inopinata的amoA基因的相似性分別可高達91%和90%，證明了該污水處理中存在著COMAMMOX，但相對豐度小于0.1%。Medini等人利用也利用宏基因組技術(shù)對來自美國、丹麥以及新加坡的6個污水處理廠生物脫氮設(shè)施中的16個樣品進行了分析檢測，發(fā)現(xiàn)均存在有COMAMMOX，且相對豐度在0.28%-0.64%之間。COMAMMOX在污水處理系統(tǒng)中廣泛存在，但相對豐度不高，在脫氮過程中的作用需要進行進一步的研究和討論。

4 COMAMMOX的代謝特征

盡管已經(jīng)有大量的文獻指出自然界和人工生態(tài)系統(tǒng)中存在著COMAMMOX，但對其代謝特征的研究還尚有不足。

在多數(shù)的自然環(huán)境中，NH4+-N的濃度較低，所以與氨氮氧化相關(guān)的三類微生物COMAMMOX、AOA以及AOB之間存在著競爭。有研究指出，AOA對氨氮的親和能力遠超過AOB，甚至可以在NH4+-N濃度極低的條件下仍可進行生長。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，全程氨氧化菌可能具有比AOA更高的氨氮親和能力。Dimitri等人經(jīng)過4年的培養(yǎng)，富集了一株COMAMMOX菌株Nitrospira inopinata，對其進行動力學(xué)測試表明，該菌與傳統(tǒng)的AOB菌群相比，具有更高的NH4+-N的親和能力和表觀產(chǎn)率系數(shù)，但氨氮氧化速率較低，故能在貧營養(yǎng)環(huán)境中進行緩慢的生長;對來自土壤和溫泉中的四種AOA也進行了動力學(xué)測試并與Nitrospira inopinata相比較，發(fā)現(xiàn)AOA的NH4+-N親和能力并沒有COMAMMOX強，Nitrospira inopinata可能具有除從海洋分離出來的AOA 即Nitrosopumilus maritimus SCM1外最高的NH4+-N親和能力。Nitrospira inopinata的高NH4+-N親和能力以及低生長速率這些代謝特征，驗證了COMAMMOX在低氨氮濃度的環(huán)境中更具有競爭力的結(jié)論。這也從生理代謝上為常常在氨氮底物貧瘠的土壤、水生環(huán)境中發(fā)現(xiàn)COMAMMOX提供了解釋。

除對NH4+-N親和能力高外，COMAMMOX也被證實具有多種代謝途徑，它們可以吸收并降解尿素作為氮源，可以幫助其在氨氮濃度受限的環(huán)境中也能有足夠的氮素來源;大多數(shù)COMAMMOX菌還可以利用H2和甲酸這類常見的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物進行生長，這也有利于他們在厭氧以及缺氧的污水處理中生存。因此，需要對COMAMMOX菌的生理生態(tài)及其代謝特征進行更多的研究，可以幫助人們更加深入的理解地球氮循環(huán)，以及污水處理過程中的氮素轉(zhuǎn)化，達到環(huán)境治理和保護的目的。

5 COMAMMOX菌的應(yīng)用前景

目前，對COMAMMOX菌的了解不甚全面，需要繼續(xù)研究他們的生化反應(yīng)機理，以及除高氨氮親和能力之外的其他的重要代謝特點，并且應(yīng)該充分利用分子生物學(xué)技術(shù)手段研究COMAMMOX在常見或者重要的自然生態(tài)系統(tǒng)和人工生態(tài)系統(tǒng)中的分布以及對氮循環(huán)的貢獻。目前，在諸多污水處理廠中均檢測到了COMAMMOX的存在，然而研究者們常常認為其氮去除的貢獻可以被忽略。但是，仍然不能忽略COMAMMOX在污水處理工程上所具有的脫氮潛力，經(jīng)過研究可能可以應(yīng)用在以下方面。

5.1 污水處理廠出水的深度處理

現(xiàn)今的城鎮(zhèn)污水處理廠的二級出水中的NH4+-N雖然遵循國家擬定的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》一級A的8.0 mg/L限值的標準，但依然高于我國擬定的《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》V類收納水體的限制值（2.0 mg/L），所以城鎮(zhèn)污水處理廠的二級出水直接排放到地表水中，依然存在破壞環(huán)境的風(fēng)險。所以，常常要采用多種方式對出水中的氨氮進行深度處理。COMAMMOX菌由于被證明具有比大多數(shù)AOB、AOA細菌都高的氨氮親和力以及低生長速率的特點，使得其在貧營養(yǎng)環(huán)境具有較高的競爭能力，可以作為一種用于污水處理廠出水深度處理的氨氧化菌，達到保護環(huán)境的目的。

5.2 減少N2O氣體的排放

傳統(tǒng)硝化-反硝化脫氮工藝在將水中的氮以氮氣形式排放的過程中，還會有N2O副產(chǎn)物的生成。N2O是一種溫室氣體，其溫室效應(yīng)約是CO2的300倍左右。以往的研究報道指出，低NH4+-N濃度時，AOA是主要的氨氧化細菌，會產(chǎn)生一定的N2O氣體;在高NH4+-N濃度時，AOB是主要的氨氧化細菌，可能產(chǎn)生較多的N2O。COMAMMOX細菌是一種將氨氮直接氧化為硝態(tài)氮的功能細菌，可以大大減少N2O的排放。所以如果將COMAMMOX進行馴化并用于高含氮廢水的處理，對減輕N2O的排放引起的溫室效應(yīng)具有重要的意義。

5.3 富營養(yǎng)水體的生態(tài)修復(fù)

近年來，地表水體的富營養(yǎng)化現(xiàn)象越來越普遍。造成水體富營養(yǎng)化的原因，便是向地表水體中排放的污水中含有氮磷等營養(yǎng)元素。水中的氮磷營養(yǎng)元素，使得水中的藻類物質(zhì)進行大量的繁殖，引起水中的溶解氧急劇降低;水中的需氧生物由于得不到氧氣的供應(yīng)，而大量死亡，最后引起水體的惡化。當(dāng)前，富營養(yǎng)水體的處理常常采用曝氣的方式使得水體的溶解氧維持在一定的水平，水中的硝化細菌得以發(fā)揮作用將氮去除。如果將COMAMMOX菌作為一種生物強化菌劑，投入到富營養(yǎng)水體中，由于其NH4+-N親和力高的特點，能夠節(jié)省曝氣能耗，達到低成本恢復(fù)富營養(yǎng)水體的目的。

6 結(jié)論

COMAMMOX菌的出現(xiàn)打破了百年來的兩段硝化理論，對理解生物硝化以及氮循環(huán)有重要的意義。本文概述了全程氨氧化的特點以及綜述了COMAMMOX的發(fā)現(xiàn)過程、在生態(tài)系統(tǒng)中的分布和代謝特征。發(fā)現(xiàn)現(xiàn)今對COMAMMOX的認識還相當(dāng)?shù)挠邢蓿杂泻芏鄦栴}，如其的生化反應(yīng)機理以及在其他生態(tài)系統(tǒng)中的分布需要進一步的研究。在COMAMMOX的工程應(yīng)用前景上，我們根據(jù)COMAMMOX的特點，指出其可能存在以下三點的應(yīng)用：（1）城鎮(zhèn)污水處理廠二級出水的深度處理;（2）減少N2O溫室氣體的排放;（3）富營養(yǎng)化水體的修復(fù)。全程氨氧化作為一種新的氮循環(huán)途徑，對其進行進一步研究，必將使得對地球氮循環(huán)以及人工強化脫氮的認識進行深刻;也可以會啟發(fā)研究者，開闊思路，繼而發(fā)現(xiàn)新的氮循環(huán)途徑。

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