基于DNA QDs@PDA熒光共振能量轉(zhuǎn)移的半胱氨酸傳感器

陳飄飄　邢怡晨　劉洋　鄭姍　黃朝表

摘 要 建立了基于DNA 量子點(diǎn)（DNA QDs）與聚多巴胺（PDA）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）檢測(cè)半胱氨酸的方法。DNA QDs發(fā)射的熒光被PDA分子吸收，發(fā)生FRET，導(dǎo)致DNA QDs的熒光猝滅，使DNA QDs處于熒光“關(guān)閉”狀態(tài)。當(dāng)存在半胱氨酸時(shí)，從多巴胺（DA）向PDA的自發(fā)氧化聚合反應(yīng)將被阻斷，使DNA QDs的熒光恢復(fù)，處于熒光“開(kāi)啟”狀態(tài)，且DNA QDs熒光的恢復(fù)程度與溶液中半胱氨酸的濃度相關(guān)，基于此構(gòu)建了半胱氨酸熒光傳感器。檢測(cè)半胱氨酸的線(xiàn)性方程為y=0.0181x-0.0185，線(xiàn)性范圍為10.0～100.0 μmol/L，檢出限為1.7 μmol/L（S/N=3，n=10），此傳感器對(duì)半胱氨酸具有良好的選擇性，常見(jiàn)氨基酸及生物硫醇小分子均無(wú)干擾。將本方法用于人尿樣中半胱氨酸的測(cè)定，回收率為98.6%～105.9%。

關(guān)鍵詞 DNA 量子點(diǎn); 共振能量轉(zhuǎn)移; 聚多巴胺; 半胱氨酸

1 引 言

半胱氨酸（Cys）是人體必需的一種含巰基的氨基酸，人體內(nèi)半胱氨酸的含量被認(rèn)為是疾病診斷的重要指標(biāo)。半胱氨酸缺乏可導(dǎo)致多種疾病，如兒童生長(zhǎng)緩慢、頭發(fā)變色、水腫、嗜睡、肝損傷、肌肉和脂肪損失以及皮膚損傷等[1，2]。

目前，檢測(cè)半胱氨酸的常用方法有光電化學(xué)分析法[3，4]、比色法[5，6]、電化學(xué)分析法[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]和熒光分析法[9，10]。然而，因半胱氨酸本身無(wú)紫外吸收，故高效液相色譜法需柱前衍生后再進(jìn)行測(cè)定，操作復(fù)雜，且衍生效果不佳; 光電化學(xué)分析法及電化學(xué)分析法耗時(shí)長(zhǎng); 比色法的靈敏度不高。熒光分析因具有靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

量子點(diǎn)（QDs）因其獨(dú)特的光學(xué)特性、良好的水溶性和生物相容性等引起了研究者的關(guān)注[11，12]， 已廣泛應(yīng)用于金屬離子[13]和生物小分子[14]測(cè)定及細(xì)胞成像[15]等領(lǐng)域。其中，無(wú)機(jī)金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)雖具有高量子產(chǎn)率和良好的光學(xué)穩(wěn)定性，但重金屬（Pb＼，Te＼，Cd等）離子的高細(xì)胞毒性和潛在環(huán)境危害，使其應(yīng)用受限[16]; 碳量子點(diǎn)（CQDs）表現(xiàn)出強(qiáng)光致發(fā)光、高化學(xué)惰性、良好的水溶性、低細(xì)胞毒性、優(yōu)越的光穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，且易實(shí)現(xiàn)綠色合成，是無(wú)機(jī)金屬半導(dǎo)體量子點(diǎn)的理想替代物[17]。最近，Guo等[18]在相對(duì)溫和的條件下通過(guò)DNA自組裝制備了一系列DNA量子點(diǎn)。研究證明，由于DNA量子點(diǎn)富含的胞嘧啶堿基對(duì)的堆疊可形成sp2碳樣中心，以此為發(fā)色團(tuán)發(fā)射熒光，且同時(shí)克服了無(wú)機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)和CQDs的缺點(diǎn)[19～22]。

多巴胺（DA）是兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，在弱堿性條件下可被空氣或溶解氧氧化成多巴胺醌，并可在水溶液中自聚合形成一系列具有不同分子量的低聚物。同時(shí)，多巴胺、多巴胺醌及其低聚物在溶液中自組裝，通過(guò)各種非共價(jià)鍵形成不同結(jié)構(gòu)的組裝體，統(tǒng)稱(chēng)聚多巴胺（PDA）[23]。因PDA較寬的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，使其成為一種應(yīng)用廣泛的熒光猝滅劑。Qiang等[24]研究了多巴胺納米球的熒光猝滅能力，發(fā)現(xiàn)猝滅能力與氧化石墨烯相當(dāng)，猝滅作用是通過(guò)能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)，基于PDA與染料標(biāo)記的DNA的結(jié)合，已開(kāi)發(fā)了DNA[25]、ATP[26]、癌細(xì)胞[27]等的測(cè)定方法。據(jù)報(bào)道，某些還原性物質(zhì)的存在，可有效抑制多巴胺的自發(fā)氧化聚合，從而有效抑制熒光猝滅效應(yīng)的發(fā)生[28]。Ma等[29]報(bào)道了一種基于染料標(biāo)記的ssDNA與PDA之間發(fā)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效應(yīng)，還原劑的存在使ssDNA的熒光恢復(fù)，建立了一種檢測(cè)還原劑的新型熒光分析方法。

本研究設(shè)計(jì)了一種基于DNA QDs@PDA的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的半胱氨酸熒光傳感器。PDA的NH2與DNA QDs的COOH之間的共價(jià)鍵作用可將DNA QDs組裝在PDA表面，并產(chǎn)生FRET，導(dǎo)致DNA QDs的熒光猝滅，使DNA QDs處于熒光“關(guān)閉”狀態(tài); 而半胱氨酸存在時(shí)，可以有效地抑制從DA向PDA的自發(fā)氧化、聚合、自組裝，從而抑制DNA QDs與PDA之間的FRET，使DNA QDs處于熒光“開(kāi)啟”狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了半胱氨酸的定量檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)、Kratos Axis ULTRA X射線(xiàn)光電子能譜儀（日本島津公司）; LZMBDA 950型紫外分光光度計(jì)（珀金埃爾默股份有限公司）; 1810D 型分析電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）; JEOL-2100F型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社）; Thermo NEXUS 670型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）; Plus-E3-20TH超純水器（南京易普易達(dá)公司）

半胱氨酸（Cys）、葡萄糖（C6H12O6）、丙氨酸（Ala）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、瓜氨酸（Cit）、精氨酸（Arg）、鳥(niǎo)氨酸（Orn）、色氨酸（Try）、纈氨酸（Val）、組氨酸（His）、多巴胺鹽酸鹽（DA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、D，L-青霉胺（PA）、D-青霉胺（D-PA）、二硫蘇糖醇（DTT）、3-巰基丙酸（MPA）、2-巰基乙酸（MAA）、2-巰基乙醇（MCE）（分析純，阿拉丁公司）; 鮭精低分子量雙鏈DNA（Sigma-Aldrich公司）。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2 DNA QDs的制備

采用水熱法制備DNA QDs[18]。將雙鏈DNA溶解于水中，配成2.5 g/L的溶液。將DNA溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯（Teflon）襯里的高壓釜中，160℃水熱反應(yīng)4 h，冷卻至室溫，即獲得DNA QDs。對(duì)DNA QDs進(jìn)行形貌、成分以及光譜表征。

2.3 DNA QDs的熒光猝滅效應(yīng)

將100 μL不同濃度（0.0、0.5、1.5、2.5、5.0、10.0和20.0 mmol/L）的DA溶液與400 μL 2.5 g/LDNA QDs溶液混合，并用10.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.7）稀釋至4.0 mL，超聲1 h后，測(cè)定熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜。另外，為了研究Cys對(duì)PDA導(dǎo)致的DNA QDs熒光猝滅的抑制作用，將不同濃度的Cys同時(shí)加入上述熒光猝滅體系中，測(cè)定熒光光譜。

2.4 半胱氨酸的測(cè)定

將不同濃度的Cys溶液與400 μL 2.5 g/L DNA QDs溶液混合，加入100 μL 2.5 mmol/L DA溶液，用Tris-HCl緩沖液稀釋至4.0 mL。反應(yīng)1 h后，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm， 測(cè)定DNA QDs的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 DNA QDs和PDA的表征

圖1A和1C分別為DNA QDs和PDA的透射電鏡 （TEM） 圖。DNA QDs和PDA在水中均具有良好的分散性，平均粒徑分別約為2.5 nm （圖1B）和10.2 nm （圖1D）。圖2A為DNA QDs的X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）圖，位于284.57、405.82、531.42和139.72 eV處的譜峰分別為C1s、N1s、O1s和P2p特征峰。圖2B為高分辨率C1s光譜，在284.7、286.0、286.2和287.8 eV處的4個(gè)峰分別歸屬于CC、 CN、 CO和CO鍵。圖2C為高分辨率O1s光譜，在530.9、531.9、532.5和533.0 eV處的4個(gè)特征峰分別歸屬為PO-4、CO、 ON和CO[18，19]。圖2D為高分辨率N1s光譜，在399.9和398.7 eV處的特征峰可分別歸屬因于N和NH2。XPS表征結(jié)果證實(shí)，DNA QDs表面包含豐富的含氧和含氮基團(tuán)。因此，DNA QDs可通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合組裝在PDA表面[30]。

3.2 DNA QDs@PDA的表征

由DNA QDs@PDA的TEM圖（圖3A）可見(jiàn)，DNA QDs@PDA在水中分散良好，平均粒徑約為14.4 nm（圖3B）。由圖3A可見(jiàn)，與DNA QDs相比，DNA QDs@PDA粒徑略有增大，證明DNA QDs結(jié)合在PDA表面。圖4中曲線(xiàn)a和b分別為DA和DNA QDs@PDA的紅外光譜圖， DA和DNA QDs@PDA在3500～3100cm-1均出現(xiàn)了NH和OH鍵伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，以及2970和 2885 cm-1附近的CH鍵伸縮振動(dòng)的弱吸收峰，且DNA QDs@PDA的吸收更強(qiáng)。另外，在500～1700 cm-1之間，吸收峰發(fā)生了很大改變，多巴胺分子的特征吸收峰幾乎完全消失，這是由于PDA和DNA QDs@PDA的生成導(dǎo)致DA分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)消失[33]，進(jìn)一步證明DNA QDs@PDA的形成。

3.3 PDA和DNA QDs的光譜性質(zhì)

圖5中曲線(xiàn)a、b和c分別為PDA的吸收光譜和DNA QDs的激發(fā)和發(fā)射光譜。DNA QDs最大激發(fā)波長(zhǎng)為367 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm，發(fā)射藍(lán)色熒光。PDA在可見(jiàn)區(qū)有連續(xù)的吸收，可與DNA QDs發(fā)生FRET效應(yīng)，導(dǎo)致DNA QDs的熒光猝滅[31]。

3.4 DNA QDs熒光猝滅及抗猝滅研究

3.4.1 pH值的影響 圖6A為pH值對(duì)DNA QDs熒光性能的影響。當(dāng)pH=7.0～9.0時(shí)，DNA QDs的熒光強(qiáng)度基本不隨pH值變化。圖6B為DA對(duì)DNA QDs的熒光猝滅率隨pH值變化的曲線(xiàn)。結(jié)果表明，當(dāng)pH=8.5時(shí)，基本達(dá)到猝滅平衡，故選擇Tris-HCl（10 mmol/L）緩沖溶液（pH=8.7）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4.2 DA濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)DNA QDs熒光猝滅的影響 隨DA濃度增大，對(duì)DNA QDs的熒光猝滅不斷增強(qiáng)，這是由于DNA QDs連接到PDA表面后，發(fā)生FRET所致[34]。當(dāng)DA濃度為2.5 mmol/L時(shí)，猝滅率達(dá)最大。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇DA的猝滅濃度為2.5 mmol/L。 隨DA與DNA QDs反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，猝滅率持續(xù)增大，在60 min時(shí)基本達(dá)到猝滅平衡。選擇猝滅反應(yīng)時(shí)間為60 min。

3.4.3半胱氨酸的抗猝滅效應(yīng) 在pH 8.7的Tris-HCl緩沖液中，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DA溶液的吸收增強(qiáng)，表明溶液中氧化產(chǎn)物和低聚物增加。當(dāng)Cys濃度為0.0 μmol/L時(shí)，DNA QDs的熒光隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)降低，即猝滅效率不斷增強(qiáng); 當(dāng)Cys濃度為100.0 μmol/L時(shí)，DNA QDs的熒光強(qiáng)度基本不隨反應(yīng)時(shí)間變化，即PDA對(duì)DNA QDs熒光的猝滅得以抑制。這是由于Cys的存在抑制了DA的氧化和聚合，從而抑制了DNA QDs@PDA體系的FRET效應(yīng)，使DNA QDs處于熒光“開(kāi)啟”狀態(tài)。

3.5 半胱氨酸的測(cè)定

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，DNA QDs和DA（2.5 mmol/L）的混合體系中，隨著Cys濃度增加，DNA QDs熒光逐漸恢復(fù)（圖7A），且DNA QDs的熒光恢復(fù)率與Cys濃度滿(mǎn)足下述方程：

其中， F和F0分別為存在Cys和不存在Cys時(shí)DNA QDs的熒光強(qiáng)度，k為猝滅常數(shù)，c為Cys的濃度。

如圖7B所示，熒光恢復(fù)率與Cys濃度在10.0～100.0 μmol/L范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為y=0.0181x-0.0185（R2=0.9962），檢出限（LOD）為1.7 μmol/L（S/N=3， n=10）。將本方法與文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較（表1），結(jié)果表明，本方法的靈敏度優(yōu)于或相當(dāng)于文獻(xiàn)方法。

3.6 熒光探針的選擇性

為了考察熒光探針對(duì)Cys的選擇性，選擇100 μmol/L Cys 與100 μmol/L氨基酸、生物硫醇小分子和葡萄糖等潛在干擾物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。如圖8所示，這些氨基酸和葡萄糖對(duì)此熒光探針的干擾均可忽略，對(duì)DNA QDs的熒光光譜幾乎沒(méi)有影響。

3.7 實(shí)際樣品分析

利用DNA QDs@PDA熒光探針測(cè)定了人體尿液樣品中Cys含量。尿樣由兩名健康志愿者提供，對(duì)尿樣進(jìn)行簡(jiǎn)單的離心和過(guò)濾處理，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表2所示，加標(biāo)回收率為98.6%～105.9%，表明本方法具有良好的實(shí)用性。

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Abstract A method for detecting cysteine based on fluorescenceresonance energy transfer （FRET） between DNA quantum dots （QDs） and polydopamine （PDA） was developed. Since the fluorescence emitted by DNA QDs was absorbed by the PDA molecule， FRET occurred， resulting in fluorescence quenching of DNA QDs， and leaving the DNA QDs in a fluorescent "off" state. In the presence of cysteine， the spontaneous oxidative polymerization from dopamine （DA） to PDA was blocked， the fluorescence of DNA QDs was restored， and the fluorescence was "on" state. Based on this， a cysteine fluorescence sensor was developed. The sensor had good selectivity to cysteine， and there was no interference between common amino acids and small biothiol molecules. The linear equation was y=0.0181x-0.0185 in linear range of 10.0-100.0 μmol/L. The limit of detection （LOD） was 1.7 μmol/L （S/N=3）. The method was successfully applied to determination of cysteine in human urine samples， with recoveries of 98.6%-105.9%.

Keywords DNA quantum dots; Fluorescence resonance energy transfer; Polydopamine; Cysteine