白藜蘆醇對膿毒癥血管舒張功能的保護作用及機制

(陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶400042)

膿毒癥是臨床常見的危重病癥，其發(fā)生率和病死率均較高。我國每年有300 萬膿毒癥患者，死于膿毒癥者約100 萬人。膿毒癥休克是指伴有持續(xù)性低血壓(即給予足量液體復蘇仍無法糾正)的嚴重膿毒癥，常伴有低灌注狀態(tài)或器官功能障礙，其病死率更高[1]。血管功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要病理生理過程，是導致組織缺血缺氧，誘發(fā)多器官功能障礙、甚至衰竭的重要原因[2]。因此，研究血管功能障礙的防治措施對膿毒癥的救治具有重要的意義。

白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種多酚類植物抗毒素，是天然的抗氧化物和自由基清除劑，主要存在于各種紅葡萄果實和紅葡萄酒中[3]。研究表明，Res能夠改善膿毒癥大鼠血管內皮的損傷，從而減輕血管內皮滲漏[4-5]。但目前，Res對膿毒癥血管反應性的作用及其機制探討較少。本研究利用膿毒癥大鼠休克模型，研究Res對膿毒癥大鼠血管舒張功能的保護作用，以及對其血流動力學、組織器官灌注及存活率的影響，進一步研究eNOS和iNOS在Res調節(jié)血管舒張反應性中的作用，為膿毒癥的救治提供新的措施。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級SD大鼠32只，12～14周齡，雌雄各半，體質量(200±20)g，由陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供；白藜蘆醇(resveratrol，Res)購自美國Sigma公司，eNOS、iNOS抗體購自美國Abcam公司。

1.2 膿毒癥模型的制備

SD大鼠術前禁食12 h，自由飲水，戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，無菌條件下開腹暴露盲腸，將糞便集中至盲腸末端，距末端約0.6 cm處用無菌線結扎，用錐形器在盲腸末端貫通穿刺，將盲腸復位后逐層縫合傷口，腹腔注射生理鹽水5 mL，放回籠中正常飼養(yǎng)。觀察大鼠平均動脈壓(mean arterial blood pressure，MAP)，當MAP下降30%或以上，建模成功，本實驗模型成功率為90%以上。

1.3 實驗方案

將32只SD大鼠隨機分為4組:正常對照組(Sham組)、膿毒癥組(Sep組)、常規(guī)治療組(CT組)、Res(10 mg/kg)治療組(Res組)，每組8只。CT組大鼠給予乳酸林格爾液體35 mL/kg復蘇，同時予以血管活性藥物多巴胺1.75 mg/kg及頭孢呋辛鈉100 mg /kg，使MAP大于70 mmHg，中心靜脈壓維持在8 mmHg。Res組在模型后尾靜脈立即給予10 mg/kg Res，12 h后行常規(guī)治療并再次給予相同劑量Res。觀察復蘇后4組腸系膜上動脈(superior mesenteric artery, SMA)舒張反應性、動靜脈流速、血流動力學(采用八道生理記錄儀記錄)、肝腎血流量、腸系膜上動脈eNOS和iNOS的表達。另取一批大鼠進行實驗，每組16只，觀察復蘇后72 h大鼠的存活時間和存活率。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 離體腸系膜血管舒張反應的測定 將SMA血管環(huán)掛于注有10 mL Krebs-Henseleit液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.03 mmol/L、MgSO4·7H2O 0.45 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、pH 7.4)的離體器官灌流槽浴槽中，持續(xù)充入含95%O2和5%CO2混合氣體，分別給予SMA血管環(huán)初張力2.0 g，37 ℃恒溫孵育約100 min，每20 min換液1次，待張力曲線平穩(wěn)后，使用NE(10-5mol/L)預收縮后測定血管環(huán)對梯度濃度Ach(10-9～10-5mol/L)的舒張性，以張力/血管環(huán)重量(g/mg)為量化標準制作濃度-張力曲線，用血管環(huán)對Ach的最大舒張反應及濃度-張力曲線評價血管舒張反應性。

1.4.2 腸系膜微血管動靜脈流速的測定 大鼠麻醉后，剪去腹部毛發(fā)，沿腹部正中剖開2～3 cm的切口，腹腔中加入37 ℃的生理鹽水，并暴露盲腸。將大鼠仰臥于觀察板上,輕輕提出小腸，并將小腸展放在有觀察孔的觀察板上，在表面連續(xù)滴加37 ℃生理鹽水保持溫度和濕度。

選取直徑為30～50 μm，200 μm長無分支，無明顯彎曲的腸系膜微血管，通過連接在顯微鏡上的超敏感攝像機(HAMAMATSU,C11440)進行觀察。在10 min基礎觀察結束后，以1 000幅/秒的速度，記錄微動靜脈的流速。用Image-Pro Plus 5.0 software軟件測定紅細胞流速，以μm/s表示大鼠腸系膜微動脈和微靜脈的血流速度。

1.4.3 肝腎血流量的測定 將各組大鼠的肝和腎暴露在激光多普勒成像儀器下(PeriCam PSI ZR，Sweden)，距離為14 cm。利用彩色圖像來表示特定部位的相對灌注水平，通過軟件(PIMsoft)分析肝和腎的血容量。

1.4.4 eNOS和iNOS蛋白表達的測定 取各組大鼠復蘇后1 h的腸系膜上動脈血管，提取其總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，取等量蛋白電泳跑膠，然后將目的蛋白轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗eNOS和iNOS (1∶2 000，abcam)和β-actin (1∶5 000， Sigma)，使用山羊抗兔及山羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，洗膜液沖洗3次后使用Odyssey Clx紅外成像儀掃描成像，條帶使用Image J 軟件分析，以目的條帶平均光密/β-actin平均光密度反映目的蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 白藜蘆醇對膿毒癥大鼠血管舒張反應性的影響

與Sham組相比，膿毒癥后血管舒張反應性明顯降低，表現(xiàn)為膿毒癥SMA對Ach的舒張反應性由Sham組的100%降低至Sep組的38.5%。常規(guī)復蘇可輕微改善膿毒癥血管舒張反應性，但與Sep組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Res可以顯著提高膿毒癥大鼠血管舒張反應性，血管舒張反應性達到85.1%，與其他組比較差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

a：SMA舒張反應性的測定；b：SMA最大舒張率 *：與Sham組比較，P<0.01；#：與CT組比較，P<0.01

圖1 Res對膿毒癥大鼠腸系膜上動脈血管舒張的變化

2.2 白藜蘆醇對膿毒癥大鼠腸系膜動靜脈流速的影響

與Sham組相比，膿毒癥后腸系膜動靜脈流速明顯降低，表現(xiàn)為腸系膜微血管動、靜脈紅細胞流速分別降低了73.6%和87.3%，差異具有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)；常規(guī)治療可輕微改善膿毒癥微血管動靜脈流速，但與Sep組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Res可明顯改善膿毒癥大鼠腸系膜微血管動靜脈流速，與CT組相比，Res組動靜脈紅細胞流速分別增加26.0%和28.0%，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

*：與Sham組比較,P<0.01；#：與CT組比較,P<0.01

2.3 白藜蘆醇對膿毒癥大鼠肝腎血流量的影響

與Sham組相比，膿毒癥后肝腎血流量明顯降低，肝血流量降低了77.1%、腎血流量降低了79.8%，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。常規(guī)復蘇可輕微改善膿毒癥大鼠肝、腎血流量。Res可明顯改善膿毒癥大鼠肝腎血流量，與CT組相比，Res組肝、腎血流量分別增加27.4%和24.6%，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

a：肝、腎血流量；b：各組肝、腎血流量的統(tǒng)計 *：與Sham組比較,P<0.01；#：與CT組比較,P<0.01

圖3 Res對膿毒癥大鼠肝腎血流量的變化

2.4 白藜蘆醇對膿毒癥大鼠血流動力學的影響

膿毒癥后大鼠血流動力學的指標迅速下降，MAP降至(46.9±8.84)mmHg，常規(guī)復蘇可輕微改善膿毒癥大鼠MAP，Res組MAP達到(82.3±13.9)mmHg，Res組可以明顯提高膿毒癥大鼠MAP，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4a。同樣，Res對膿毒癥大鼠左室最大收縮壓(LVSP)、左室內壓最大上升/下降速率(±dp/dt max)也有明顯的改善作用(P<0.01)，見圖4b～d。

a：MAP；b：LVSP；c、d：±dp/dt max *：與Sham組比較,P<0.01；#：與CT組比較，P<0.01

2.5 Res對膿毒癥大鼠腸系膜上動脈eNOS和iNOS蛋白表達的變化

與Sham組相比，膿毒癥后腸系膜血管eNOS的表達明顯降低，iNOS的表達明顯升高，常規(guī)復蘇對eNOS和iNOS的表達有輕微的改變。Res處理后膿毒癥大鼠血管eNOS和iNOS的表達明顯改善，表現(xiàn)為eNOS的表達明顯升高，iNOS的表達明顯降低(圖5)。

2.6 白藜蘆醇對膿毒癥大鼠存活率、存活時間的影響

Sep組大鼠存活率低、存活時間短，72 h存活率、存活時間分別為6.25%(1/16)和6.5 h；常規(guī)治療后可部分改善膿毒癥大鼠存活率和存活時間，72 h存活率、存活時間分別為12.5%(2/16)和14 h(P<0.05)；Res可以顯著提高膿毒癥大鼠的存活率，延長存活時間，72 h存活率增加至62.5%(10/16)，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

a:Western blot分析；b:各組eNOS和iNOS相對表達量 *：與Sham組比較,P<0.05；#：與CT組比較,P<0.05

圖5 大鼠腸系膜血管eNOS和iNOS蛋白表達的變化

3 討論

在膿毒癥和膿毒性休克中，舒張功能不全的患者對液體負荷的反應性差，且其預后也較差[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，Res對膿毒癥大鼠SMA血管舒張反應性具有明顯的保護作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Res可以改善膿毒癥大鼠的血流動力學進而提高組織灌注量，最終提高膿毒癥大鼠的存活率和存活時間。究其機制可能為，Res通過調控血管eNOS和iNOS的表達來改善膿毒癥大鼠的血管舒張反應性。

白藜蘆醇是廣泛存在于葡萄皮、花生等植物中的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗心血管疾病、抗衰老和調節(jié)免疫等多種生物活性[7-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，Res在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的保護作用，如缺血-再灌注損傷、心肌梗死和糖尿病等[11-13]。有研究證實，Res可以保護膿毒癥血管內皮的屏障功能，如通過抑制氧化應激、降低炎癥因子水平從而減少膿毒癥大鼠所致的急性肺損傷、肝損傷[5,14-15]。而Res對血管反應性的研究很少，Carrizzo等[10]發(fā)現(xiàn)，Res可改善高血壓患者的血管舒張功能。本研究發(fā)現(xiàn)，Res主要通過調節(jié)血管eNOS和iNOS的表達從而調節(jié)血管舒張功能，實現(xiàn)對整體器官的保護作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥后NO產(chǎn)生過多，iNOS的表達增加，而eNOS的表達降低[16]。同時，轉基因動物實驗表明，eNOS過表達可降低LPS誘導膿毒癥小鼠的高病死率，說明eNOS和iNOS在調節(jié)血管功能方面發(fā)揮著重要作用[2]。目前研究證實，Res對eNOS和iNOS的表達有調節(jié)作用，如：Feng等[3]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過激活eNOS的表達，增加了NO的生物利用率；Youn等[17]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制炎癥引起的iNOS增加和NF-κB的激活。本研究也發(fā)現(xiàn)，Res可以增加血管eNOS的表達及降低iNOS的表達，最終實現(xiàn)對血管舒張功能的保護作用。但是，Res是如何調控膿毒癥后血管eNOS和iNOS水平尚不清楚。有研究證實，Rac-1和HIF-1α在調節(jié)eNOS和iNOS的表達中發(fā)揮著重要的作用，如：Cho等[18]發(fā)現(xiàn)，抑制Rac-1的激活可以增加eNOS，降低iNOS的表達，從而改善大鼠心臟衰竭導致的內皮氧化損傷；Matrone等[19]證實，在大鼠大腦中動脈閉塞的模型中，HIF-1α的激活會介導iNOS表達的增加；Wung等[20]證實，白藜蘆醇可以抑制內皮細胞中IACM-1 和Rac-1的表達，從而改善內皮細胞的屏障功能；Yao等[21]的研究也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制結腸炎中HIF-1α的轉錄和激活。在膿毒癥大鼠的模型中，白藜蘆醇是否通過抑制Rac-1和HIF-1α的表達來調節(jié)eNOS和iNOS的表達，還有待進一步研究。

綜上，白藜蘆醇通過改善膿毒癥大鼠的血管舒張反應性，從而實現(xiàn)了對整體器官的保護作用。