表觀遺傳學藥物對彌漫大B細胞淋巴瘤SU-DHL-4細胞株增殖及SHP-1基因表達的影響*

劉 林 李佳佳 張 鳳

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽 蚌埠 233000

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse largeB-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤。有文獻報道DLBCL在歐美國家NHL發(fā)病率約占40%[1]，在發(fā)展中國家的發(fā)病率比例更高。因此積極尋找更多的治療靶點是十分必要的。表觀遺傳學是指基因表達或蛋白表達的改變不涉及DNA序列變化，但又可穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，主要包括基因組印記、DNA甲基化、組蛋自修飾和非編碼RNA等。DNA甲基化與組蛋白乙?；赏ㄟ^甲基CpG結合蛋白(MeCP)協(xié)同調控基因表達，因而可通過甲基轉移酶抑制劑與HDACI協(xié)同抑制腫瘤細胞，使失活的抑癌基因恢復功能，克服耐藥性，減輕不良反應，發(fā)揮更強的抗腫瘤作用。鑒于此，本研究采用去甲基化藥物5-Aza-CdR及SAHA處理彌漫大B細胞淋巴瘤SU-DHL-4細胞株，觀察5-Aza-CdR及SAHA對SU-DHL-4細胞增殖的影響及其對SHP-1表達水平的變化，探討其作用與機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器與試劑

紫外分光光度儀(型號：NANODROP 8000，美國Thermo Scientific公司)；反轉錄及實時熒光定量PCR所用試劑(日本TaKaRa公司)；GAPDH及SHP-1引物(上海英駿生物公司合成)；5-Aza-CdR、SAHA、MTT試劑(美國Sigma公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

SU-DHL-4細胞株(上海瑞金醫(yī)院血液學研究所趙維蒞教授饋贈)。從液態(tài)氮罐取出后，用含有10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，放置于培養(yǎng)箱(溫度37 ℃、5%CO2、空氣飽和濕度95%)。每2 d換液傳代。5-Aza-CdR處理細胞時，維持細胞密度在0.5×106～1×106/ml，用終濃度為1μM的5-Aza-CdR處理細胞，隔日半量換液，補加新鮮培養(yǎng)液和藥物調整至終濃度，持續(xù)培養(yǎng)48 h后，再加入終濃度為2μM的SAHA，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，第4 d收集1×107以上數(shù)量細胞進行檢測。

1.3 MTT實驗

檢測不同濃度的5-Aza-CdR和SAHA單用及聯(lián)合使用對各細胞株的增殖抑制作用。各細胞株，以每孔15000個細胞分別將細胞懸浮于濃度為0.25μM、0.5μM、1μM和2μM的5-Aza-CdR和SAHA培養(yǎng)液中，接種于96孔板中。設對照組(不加藥)和空白孔組(只有培養(yǎng)液無細胞)。先用5-Aza-CdR處理48 h，然后加用SAHA繼續(xù)處理24 h；72 h后，向每孔中加入0.1 mg MTT， 37 ℃作用4 h后，每孔加入180 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在全自動酶標儀490 nm處測量標本吸光度(A)值并記錄數(shù)據，計算平均A值，按照公式計算細胞生長抑制率。實驗設3復孔，反復實驗3次。細胞生長抑制率=(1-A加藥組/A對照組)×100%

1.4 SYBR Green熒光染料標記的實時熒光定量PCR

分別用終濃度為用1 μmol/L的5-Aza-CdR、2μmol/L的SAHA及兩藥聯(lián)合應用處理SU-DHL-4細胞，培養(yǎng)72h后收集對照組與加藥組細胞，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，用分光光度法檢測RNA的濃度和純度，A260/A280比值均為1.9～2.1，按試劑盒說明書要求采取兩步法反轉錄成cDNA，以GAPDH基因作為內參。設計過程：首先，在Nucleotide中查找基因序列，然后使用軟件Primer 3.0設計，最后做BLAST分析核對引物的特異性及可行性。PCR反應分三步：第一步，95 ℃，30 s；第二步，95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；第三步，95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；共40個循環(huán)。同時擴增SHP-1基因和內參基因，溶解曲線檢測產物的特異性，所得結果和同期擴增內參基因做比較，用基因相對定量法(2-ΔΔCt)計算各組基因相對于對照組的表達倍數(shù)：ΔCt=待測基因CT值-內參基因CT值，-ΔΔCt=待測基因ΔCt-對照基因ΔCt，每個基因做3個復孔，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，結果采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK-q檢驗， 以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 5-Aza-CdR及SAHA對SU-DHL-4細胞增殖的抑制作用

各濃度5-Aza-CdR及SAHA均可以不同程度的抑制細胞生長，且表現(xiàn)為濃度依賴性。在終濃度為0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、和2μmol/L5-Aza-CdR及SAHA對SU-DHL-4細胞的抑制率分別為8.13%、13.42%、28.07%、43.39%和6.99%、10.38%、14.87%、21.03%，1μmol/L5-Aza-CdR及2μmol/SAHA聯(lián)合應用后，SU-DHL-4細胞的增殖抑制率增高為52.23%，且不同藥物濃度間吸光度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(表1)

表1 5-氮雜-2’-脫氧胞苷對彌漫大B細胞淋巴瘤SU-DHL-4細胞株增殖抑制情況

注：細胞生長抑制率=(1-A加藥組/A對照組)×100%；a與對照組比較；加藥組內各組間比較，P<0.01.

2.2 5-Aza-CdR及SAHA對SU-DHL-4細胞SHP-1基因表達的影響

擴增曲線可見GAPDH及SHP-1基因擴增一致，分析融解曲線可以確定SHP-1基因產物的特異性(表2)。對其進行相對定量分析，可見加藥組SHP-1基因表達量升高，其中去甲基化藥物5-Aza-CdR使基因表達量增加的更明顯，并且兩藥聯(lián)合應用后SHP-1的表達量進一步增加,兩兩比較均可見統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表2 SHP1 mRNA相對表達情況

注：相對表達量為2-ΔΔCt表示；a與對照組比較；任意各組兩兩比較，P值均<0.01。

3 討 論

DLBCL是是一種高侵襲性腫瘤，也是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，在細胞起源、形態(tài)學、免疫組織化學表型、分子遺傳學、累及部位、化療反應及生存率等方面都表現(xiàn)出明顯的異質性。近年來，隨著CD20單克隆抗體-美羅華的使用，使生存率有了顯著性提高，但仍有部分復發(fā)難治患者可因疾病進展生存期明顯下降。

5-Aza-CdR是脫氧胞苷的類似物，可以通過整合入DNA干擾DNA對甲基的接受能力，或直接抑制DNA甲基轉移酶活性，最終導致DNA甲基在細胞分裂周期中進行性丟失而產生低甲基化，使某些基因重新激活，因此其可作為一種表觀遺傳學藥物干預腫瘤中相關基因的表達[2]。SAHA屬羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿?，可通過抑制在腫瘤細胞中過度表達的HDAC，提高染色質特定區(qū)域組蛋白乙?；泻徒M蛋白的電荷，引起核小體結構松弛，從而使各種轉錄因子和協(xié)同轉錄因子能與DNA結合位點特異性結合，激活部分抑癌基因的轉錄，調控抑癌基因的再表達，誘導細胞凋亡。可以通過增加組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，中和組蛋白的電荷，使DNA結構變得更加松散、開放，增加轉錄因子的進入，從而促使某些沉默的抑癌基因重新表達。SHP-1基因位于第12號染色體的p12-p13區(qū), 是一種含有SH2結構域且主要在造血細胞中表達的胞質蛋白 - 酪氨酸磷酸酶[3], 是信號轉導中的重要調節(jié)因子[4]。K.Amara等[5]發(fā)現(xiàn)了B細胞淋巴瘤/白血病病人病理組織中SHP-1基因高頻率的高甲基化狀態(tài)，且SHP-1甲基化患者的生存期有縮短的趨勢，提示SHP-1基因沉默是疾病發(fā)生的關鍵事件之一。

5-Aza-CdR能使甲基化沉默的基因重新被激活，恢復其正常功能。HDAC抑制劑主要是通過改變組蛋白的乙酰化程度來干擾腫瘤細胞內組蛋白乙?；腿ヒ阴；癄顟B(tài)的平衡，可引起染色體重建和細胞周期停滯、誘導細胞分化和自噬、調控轉錄因子、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤抑制基因的脫乙酰基作用[6]。本實驗中，對于彌漫大B細胞淋巴瘤SU-DHL-4細胞株給予5-Aza-CdR及SAHA處理后可發(fā)現(xiàn)對其增殖有較明顯的抑制作用，聯(lián)合用藥組抑制率更高，且各加藥組吸光度之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時，定量PCR檢測到加藥后SHP-1在基因和蛋白水平均恢復表達，聯(lián)合用藥組較單藥組表達量更高，其中單用5-Aza-CdR較單用SAHA組SHP-1表達恢復的更明顯，可能是去甲基化藥物5-Aza-CdR在降低SHP-1啟動子區(qū)的甲基化的作用更大，也更直接一些。

總之，經本實驗進一步證實5-Aza-CdR及SAHA具有抑制彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖的作用，同時，針對加藥后SHP-1表達量的明顯升高，我們進一步驗證了特異性甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR及組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可通過去甲基化及組蛋白乙?；缺碛^遺傳修飾，重新激活沉默的SHP-1基因，促使SHP-1基因恢復表達，從而起到抑制SU-DHL-4細胞增殖的作用。