沙米生長特性調(diào)查及遺傳多樣性分析

聶峰杰,甘曉燕,張 麗,鞏 檑,劉 璇,楊文靜,宋玉霞

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002)

沙米(Agriophyllumsquarrosum)別名沙蓬，藜科(Chenopodiaceae)沙蓬屬(Agriophullum)，一年生草本流動沙丘先鋒植物和優(yōu)勢物種，主要生長于流動沙丘、半固定沙地戶外丘間低地，廣泛分布于我國西北、華北各省的沙漠地帶[1-3]。沙米種子富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、粗纖維和灰分，是適宜人類食用的營養(yǎng)食品[4]；同時沙米種子含有所有人體必需氨基酸，其蛋白質(zhì)氨基酸模式與人體蛋白質(zhì)氨基酸模式接近，是優(yōu)良的功能食品，具有助消化、健脾胃、清熱解毒、抗菌消炎等功效，是天然減肥食品和心腦血管、腎臟功能減退、糖尿病病人的理想食品[5-7]；沙米籽油主要成分為亞油酸、油酸和次亞油酸3種不飽和脂肪酸，有助于降低人體血清膽固醇和抑制動脈血栓[7-8]；沙米中還富含硒、鋅、鐵等元素[5，9]，生理活性物質(zhì)皂甙、異黃酮、SOD及綠原酸生物堿含量較多[6]。沙米的食用歷史悠久，據(jù)《沙洲都督府圖經(jīng)》記載，早在1300多年前敦煌人民便大量采集沙米做軍糧[10]，至今，沙米做的炒面、涼粉、點(diǎn)心、羊肉面等仍是甘肅河西走廊和內(nèi)蒙古等地備受歡迎的特色美食。沙米在長期進(jìn)化過程中形成耐干旱、耐高溫、耐貧瘠、耐風(fēng)蝕、耐沙埋等特性，具有重要的生態(tài)價值、營養(yǎng)價值。開展沙米種植資源調(diào)查和遺傳多樣性研究，對優(yōu)良種質(zhì)資源篩選有重要意義。SSR(Simple sequence repeats)標(biāo)記具有分布均勻、覆蓋整個基因組、多態(tài)性高、共顯性分離、位點(diǎn)轉(zhuǎn)化型等優(yōu)點(diǎn)，在燕麥(Avenasativa)[11]、苜蓿(Medicago)[12]、白羊草(Bothriochloaischaemun)[13]、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)[14]等牧草和作物種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用。

寧夏回族自治區(qū)和甘肅、內(nèi)蒙古兩省沙米野生種質(zhì)資源豐富，本研究針對不同原生地開展了沙米的物候期調(diào)查，分析了不同地區(qū)沙米的形態(tài)、種子營養(yǎng)成分，利用SSR分子標(biāo)記對寧夏回族自治區(qū)和內(nèi)蒙古、甘肅兩省的17個自然居群沙米進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期明確不同地區(qū)沙米的生長特性、種子品質(zhì)和遺傳多樣性，為后期沙米優(yōu)良種質(zhì)資源篩選、育種和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查采樣地概況及種質(zhì)資源材料

2018—2019年度在寧夏銀川濱河新區(qū)(NY)、甘肅民勤縣(GM)、甘肅武威市(GW)、內(nèi)蒙古阿拉善左旗(NA)對沙米種質(zhì)資源立地類型、物候期、器官形態(tài)學(xué)進(jìn)行定點(diǎn)觀測，對沙米種子中淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分進(jìn)行測定分析。

寧夏銀川市濱河新區(qū)位于毛烏素沙漠西緣腹地，典型大陸性氣候特征，光熱充足，日溫差較大，干旱少雨，蒸發(fā)強(qiáng)烈，風(fēng)大沙多。多年平均降雨量180～220 mm，多集中在7—9月，占全年降水量的61.6%。年均蒸發(fā)量2 088.2 mm，為年降水量的10.5倍，年均相對濕度為56%。

甘肅民勤縣西沙窩位于巴丹吉林沙漠和騰格里沙漠之間，典型大陸性荒漠氣候，降水稀少，蒸發(fā)強(qiáng)烈，風(fēng)大沙多，平均氣溫7.6℃，年均降水量115.41 mm，主要集中在7—9月，占年均總降水量的60%以上，年均蒸發(fā)量為2 664.0 mm，沙質(zhì)荒漠草地流動、半固定沙丘。

甘肅省武威市東沙窩位于騰格里沙漠的南部,典型的溫帶半荒漠大陸性氣候。年均氣溫9.9℃，年均降雨量139.9 mm，年平均蒸發(fā)量2 486 mm，屬極干旱地區(qū)。

阿拉善左旗通古淖位于騰格里沙漠的東部，屬溫帶荒漠干旱區(qū)，為典型的大陸性氣候，干旱少雨，夏熱冬寒，日照充足，蒸發(fā)強(qiáng)烈。年平均氣溫7.4℃，年降雨量40～50 mm，集中在6—9月，年蒸發(fā)量3 000～4 500 mm。

選擇4個地區(qū)17個自然居群(表1)，隨機(jī)收集8株以上的沙米葉片，提取DNA用于SSR多樣性檢測。

表1 17份沙米種質(zhì)資源采樣地點(diǎn)

1.2 研究方法

1.2.1 沙米物候期調(diào)查及形態(tài)觀察 在每個調(diào)查試驗地依據(jù)沙丘走向設(shè)置樣線，平行設(shè)置3個1 m×1 m的樣方，每個樣方間隔10 m，共設(shè)置9個樣方。根據(jù)沙米生長的實際情況，以沙米萌發(fā)、分枝期、開花、結(jié)果為不同物候期的界定指標(biāo)，以20%～80%的沙米植株出現(xiàn)物候觀測指標(biāo)的時間區(qū)間確定為物候期。開花期采集沙米葉片、莖、花，利用體視鏡20倍下觀察沙米葉脈、花被片、雄蕊、花絲、花藥等形態(tài)。

1.2.2 沙米種子營養(yǎng)成分分析 種子成熟后收集各樣方中沙米種子，混合后各取3次重復(fù)檢測營養(yǎng)成分。蛋白含量參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[15]標(biāo)準(zhǔn)中凱氏定氮法測定，脂肪含量參照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》[16]標(biāo)準(zhǔn)中索氏抽提法測定，直鏈淀粉測定采用GB/T 15683-2008比色法;支鏈淀粉測定參照金玉紅等[17]的雙波長比色法; 氨基酸含量參照 GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[18]標(biāo)準(zhǔn)測定。種子營養(yǎng)成分檢測為3次重復(fù)平均值。

1.2.3 基因組DNA提取 采用TIANGEN公司的離心柱式植物DNA提取試劑盒DP320-02提取。獲得的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計(Theromg公司，美國)，檢測合格后，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至50 ng·μL-1備用。

1.2.4 SSR分析 選取23對多態(tài)性較高的SSR引物[19-20]對17份沙米資源進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出13對(SF26、SF30、SF63、SF21、SF80、SM0027、SM0105、SM0097、SM0118、SM0137、SM0138、SM0148、SM0032)多態(tài)性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的引物用于本次試驗。采用SSR-PCR反應(yīng)體系為每20 μL反應(yīng)體積中含有1×Mix，0.4 mM SSR引物，100 ng DNA模板。反應(yīng)程序為模板預(yù)變性94℃反應(yīng)5 min后，94℃模板DNA變性30 s，復(fù)性為50℃～60℃反應(yīng)30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后延伸為72℃反應(yīng)10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原生地沙米物候期調(diào)查

不同地區(qū)沙米的萌發(fā)、分枝、開花、結(jié)果、成熟的生長周期見表2。調(diào)查結(jié)果顯示，4個地區(qū)的沙米生長周期為4月下旬到10月中旬，共150 d以上，寧夏銀川市濱河新區(qū)沙米萌發(fā)時間較甘肅武威、甘肅民勤和內(nèi)蒙古阿拉善晚10 d左右。

表2 不同原生地沙米物候期調(diào)查

2.2 不同原生地沙米形態(tài)比較

對不同地區(qū)沙米的葉片、莖、花等器官進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的沙米株高、種子千粒重、器官形態(tài)略有差別(見表3)。甘肅武威和甘肅民勤沙米株高和種子千粒重略高，株高可達(dá)128～130 cm，種子千粒重可達(dá)1.56～1.59 g；甘肅武威、甘肅民勤、內(nèi)蒙古阿拉善的沙米葉長2～7 cm，寬0.1～0.7 cm，葉脈3～7條，花被片1～3，雄蕊2～3，花絲錐形，花藥卵圓形；寧夏銀川的沙米葉長1.5～5 cm，寬0.2～0.9 cm，葉脈5～9條。花被片1～3;雄蕊2～3，花絲錐形，花藥長圓形。

注：A～D：內(nèi)蒙古阿拉善沙米；A：葉片；B：莖；C：花藥：D：子房。a～d：寧夏銀川沙米；a：葉片； b：莖；c：花：d：子房。Note: A～D: Agriophyllum squarrosum from NA；A:leaf；B：stem；C：anther；D:ovary. a～d：Agriophyllum squarrosum from NY；a:leaf；b：stem；c：anther；d:ovary.

表3 不同原生地沙米種質(zhì)生物學(xué)特性和器官形態(tài)特征

2.3 不同原生地沙米種子營養(yǎng)成分分析

對4個地區(qū)沙米種子的淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、硬脂酸、亞油酸、粗脂肪、氨基酸含量等營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了檢測分析見圖2，結(jié)果表明，4個地區(qū)沙米種子淀粉含量達(dá)278.00～307.46 mg·g-1，支鏈淀粉含量達(dá)164.50～185.45 mg·g-1，直鏈淀粉含量達(dá)94.03～103.61 mg·g-1，其中來自甘肅民勤沙米種子的淀粉、支鏈淀粉、直鏈淀粉含量顯著高于其他3個地區(qū)；4個地區(qū)沙米種子蛋白質(zhì)和氨基酸含量分別達(dá)到107.8～103.36 mg·g-1和30.32～49.85 μmol·g-1，甘肅民勤、甘肅武威、內(nèi)蒙古阿拉善沙米種子的蛋白質(zhì)含量顯著高于寧夏銀川地區(qū)，甘肅武威的沙米種子氨基酸含量達(dá)到49.85 μmol·g-1，顯著高于其他3個地區(qū)；4個地區(qū)沙米種子中粗脂肪含量為46.80～54.90 mg·g-1，硬脂酸含量為9.23～15.47 mg·g-1，亞油酸含量為14.23～20.97 mg·g-1，其中甘肅民勤的沙米種子粗脂肪、硬脂酸、亞油酸含量分別達(dá)到54.90、15.47 mg·g-1和20.97 mg·g-1，顯著高于其他3個地區(qū)。

注：不同小寫字母表示同一種營養(yǎng)物質(zhì)的含量在α=0.05水平差異顯著。Note: Different lowercase letters represent significant difference of the amount of the same nutrient (ANOVA, α=0.05).

2.4 不同原生地沙米種質(zhì)SSR多態(tài)性分析

按照最適反應(yīng)體系及程序，利用23對SSR分子標(biāo)記對3個省、自治區(qū)的17份沙米種質(zhì)資源DNA進(jìn)行了SSR遺傳多樣性分析，篩選出13對特異性較好的SSR引物(見圖3)，分別為SM0027、SM0105、SM0097、SM0118、SM0137、SM0138、SM0148、SM0032、SM0042、SF80、SF26、SF21、SF30、SF63，共檢測到76個條帶，其中有39條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為51.3%。其中引物SF63的擴(kuò)增條帶為6條，引物SM0118擴(kuò)增條帶為4條。17份沙米材料的遺傳變異較穩(wěn)定，有一定的多態(tài)性，SSR標(biāo)記能夠解釋沙米基因組部分信息量。

圖3 引物SM0118和SF63對17份沙米樣品擴(kuò)增的電泳圖譜

2.5 不同原生地沙米種質(zhì)遺傳變異及聚類分析

利用NTSYSpc (Version 2.10e)軟件對14條引物擴(kuò)增出的76個條帶進(jìn)行了分析，平均法聚類結(jié)果顯示，每個SSR位點(diǎn)的PIC值為0.37～0.60，平均值為0.45。3個省、自治區(qū)沙米種質(zhì)資源遺傳相似性系數(shù)介于0.28～0.71之間。根據(jù)遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建17個沙米種植資源遺傳關(guān)系聚類圖(見圖4)，結(jié)果表明，17份種質(zhì)資源居群水平的有一定的遺傳多樣性，與部分資源表觀差異相一致。以0.58作為相似性系數(shù)分界點(diǎn)，17份沙米資源分為3類，采自寧夏濱河新區(qū)的6號資源、內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)9號資源各分成為一類，甘肅民勤、甘肅武威、寧夏中衛(wèi)等地區(qū)15份資源同為一類，其材料遺傳相似度高，在地理位置上均屬于騰格里沙漠腹地。

圖4 17份沙米種質(zhì)資源的UPGMA聚類圖

3 討 論

沙米生長在沙漠干旱環(huán)境中，可發(fā)揮防風(fēng)固沙的生態(tài)作用。沙米種子萌發(fā)呈連續(xù)狀，生長季節(jié)初降雨后部分沙米種子首先萌發(fā)，隨著生長推進(jìn)，大部分幼苗因缺水、高溫、沙埋風(fēng)蝕等不良環(huán)境因素影響而死去。雨季來臨后，沙米種子大量可萌發(fā)生長為成熟個體。沙米種子具有光抑制和休眠機(jī)制[22]，為適應(yīng)沙漠的惡劣環(huán)境，種子萌發(fā)受光照、溫度、水分等諸多因素影響，不同年份、不同地區(qū)間植株生長的物候期受環(huán)境影響有較大差異，這種特性可以有效保護(hù)沙米種子，有利于種群的繁衍更新。

沙米種子營養(yǎng)豐富，具有人體所需的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，我們所調(diào)查的4個原生地沙米種子的淀粉含量達(dá)到278.00～307.46 mg·g-1，蛋白質(zhì)含量達(dá)到107.8～103.36 mg·g-1，粗脂肪含量為46.80～54.90 mg·g-1，其中被公認(rèn)具有降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進(jìn)微循環(huán)作用的亞油酸含量達(dá)14.23～20.97 mg·g-1。沙米含有所有人類必需氨基酸，并且含量都高于藜麥、小麥和稻米[23]。由此可見，沙米不僅是營養(yǎng)價值極高的綠色有機(jī)食品，在醫(yī)療保健領(lǐng)域也具有巨大的開發(fā)潛力。沙米植株地上生物量較大，株高可達(dá)130 mm，開花前葉片柔軟，葉量較豐富，鮮草含水量77%，粗蛋白4.4%、粗脂肪0.4%、粗纖維3.7%、無氮浸出物8.7%、粗灰分5.1%[24]，是荒漠及荒漠草原地區(qū)的重要飼用植物，具有飼草開發(fā)價值。

沙米生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，營養(yǎng)成分豐富，具有多方面的應(yīng)用價值，極具人工馴化種植和產(chǎn)品開發(fā)的潛力。本研究調(diào)查分析4個不同原生境沙米的生長特性和種子品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地沙米的生長特性和種子營養(yǎng)成分含量有差異，甘肅民勤地區(qū)的沙米株高、種子千粒重、淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量均優(yōu)于其余3個地區(qū)。利用SSR分子標(biāo)記對來自3個省、自治區(qū)17份自然居群的沙米種質(zhì)資源進(jìn)行遺產(chǎn)多樣性分析，檢測到76個條帶，其中有39條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為51.3%。同時，聚類分析結(jié)果表明，來自寧夏銀川市濱河新區(qū)(NY)的資源與其他16份沙米資源遺傳距離最遠(yuǎn)，與生物學(xué)特性調(diào)查及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果相一致，說明SSR分子標(biāo)記可以區(qū)分17份種質(zhì)資源的遺傳多樣性。研究結(jié)果可為擴(kuò)展沙米種植資源的研究、利用，優(yōu)良種植挖掘、培育新品種提供研究基礎(chǔ)。