施用生物菌肥對(duì)桃園土壤養(yǎng)分及微生物功能多樣性的影響

于會(huì)麗，徐國(guó)益，徐變變，袁玉潔，邵 微,2，王新衛(wèi)，朱更瑞，魯振華，司 鵬

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所，河南 鄭州 450009；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002)

生物菌肥是由一種或多種有益微生物經(jīng)發(fā)酵而成的具有高效廣譜、綠色環(huán)保、安全無(wú)毒特性的生物性肥料[1-3]。除含有較高有機(jī)質(zhì)外，還含具有特定功能的有益微生物，不僅活化土壤養(yǎng)分，改善土壤理化性質(zhì)[4]和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[5]，提高土壤肥力[6-8]，還促進(jìn)作物養(yǎng)分吸收，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[9-10]，增強(qiáng)作物抗病和抗逆性[11-12]。劉德興等[13]在甜瓜上施用生物菌肥發(fā)現(xiàn)，生物菌肥能夠提高甜瓜單果重和改善甜瓜品質(zhì)。陶愛(ài)群等[14]的研究表明，施用生物菌肥可改善玉泉冬棗的光合作用及提高果實(shí)產(chǎn)量和改善果實(shí)品質(zhì)。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分和土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要參與者[15]，在土壤有機(jī)物質(zhì)分解、養(yǎng)分釋放和能量轉(zhuǎn)移中起著重要作用[16]。隨著人們對(duì)生物多樣性重要性認(rèn)識(shí)的不斷深入，廣泛應(yīng)用各種測(cè)定方法，如微生物醌法、脂肪酸法、TGGE、DGGE和Biolog 法等研究微生物代謝功能多樣性，微生物醌法、脂肪酸法、TGGE和DGGE等技術(shù)方法無(wú)法獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息[17]，Biolog 方法可克服這一缺點(diǎn)，被廣泛用于評(píng)價(jià)土壤微生物的功能多樣性[18]。司鵬等[19]通過(guò)Biolog 法研究表明，在葡萄行間種植毛葉苕子能顯著增加土壤微生物群落對(duì)六類(lèi)碳源的利用。陳琳等[20]采用Biolog 法研究生物有機(jī)肥對(duì)板栗土壤微生物群落代謝活性的影響，結(jié)果表明，生物有機(jī)肥處理能提高土壤中微生物的活性。趙蘭鳳等[21]利用 Biolog 法分析了不同施肥處理對(duì)香蕉根際土壤微生物群落功能多樣性的影響，表明生物有機(jī)肥處理的根際微生物活性和土壤微生物對(duì)聚合物類(lèi)和胺類(lèi)的利用能力均高于對(duì)照和有機(jī)肥。然而有關(guān)生物菌肥對(duì)桃園土壤微生物功能多樣性影響的相關(guān)研究較少。

本研究采用 Biolog-Eco 板技術(shù)，研究生物菌肥不同施用量對(duì)桃園土壤微生物功能多樣性及有效養(yǎng)分的影響，明確其最佳施用量，為生物菌肥在桃生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地基本情況

試驗(yàn)區(qū)位于新疆西部中心昌吉國(guó)家農(nóng)業(yè)園區(qū)老龍河大棚試驗(yàn)基地(44°15′36″N，87°20′53″E)。海拔470 m，日照充足，年日照時(shí)數(shù)為2 700 h，年平均氣溫6.8℃，年平均降水量為190 mm，夏季降水量明顯多于冬季，年無(wú)霜期為175 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年9月15日進(jìn)行，設(shè)置5個(gè)處理：雞糞2 000 kg·667m-2(CK)，生物菌肥200 kg·667m-2(T1)，生物菌肥300 kg·667m-2(T2)，生物菌肥500 kg·667m-2(T3)，生物菌肥1 000 kg·667m-2(T4)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積25 m2(5m×5m)，共種植18棵桃樹(shù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每相鄰小區(qū)間隔1排桃樹(shù)作為保護(hù)行。單邊溝施，溝深30cm，溝寬30～40 cm，所有處理均將肥料一次性施入并與土混合均勻。

1.3 試驗(yàn)材料

供試生物菌肥有效活益菌≥2×108CFU·g-1，功能菌為解淀粉芽孢桿菌和多粘類(lèi)芽孢桿菌，有機(jī)質(zhì)≥50%，蛋白質(zhì)≥30%，N+P2O5+K2O≥10%，特別添加抗病性有益菌和鐵、錳、硼、鋅等微量元素，該產(chǎn)品執(zhí)行NY884-2012肥料標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照用的雞糞有機(jī)質(zhì)≥48.58%，N+P2O5+K2O≥10%。

1.4 土樣采集

2019年5月13日采集土樣，取樣方法為梅花形布點(diǎn)法，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)選5個(gè)點(diǎn)，沿桃樹(shù)樹(shù)冠垂直投影面積2/3處取0～20 cm和20～40 cm土壤樣品，剔除石塊、植物殘根等雜物后，每個(gè)小區(qū)同層土樣混合。一部分土樣風(fēng)干過(guò)篩進(jìn)行土壤理化性質(zhì)測(cè)定，一部分土樣貯藏于-80℃冰箱進(jìn)行土壤微生物功能多樣性測(cè)定。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤pH值采用pH計(jì)測(cè)定，水土比為2.5∶1；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法，有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提法，速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法，硝態(tài)氮用酚二磺酸比色法，銨態(tài)氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法[22]。

1.5.2 土壤微生物群落測(cè)定 將相當(dāng)于1 g烘干土的新鮮土壤加入到盛有99 mL 0.85%滅菌生理鹽水的250 mL 三角瓶中，28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)30 min，使土樣與生理鹽水充分混勻，再放置在4℃冰箱內(nèi)靜置30 min，然后加樣于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入150 μL。25℃下培養(yǎng)192 h，每24 h Biolog自動(dòng)讀取儀讀數(shù)1次。

微生物群落功能多樣性的計(jì)算[23]：

Biolog-Eco板測(cè)定平均吸光值(average well color development，AWCD)，用來(lái)表示微生物的整體代謝活性[23]：

AWCD=∑(Ci-R)/n

Shannon-Wiener指數(shù)(H′)：

H′=-∑(Pi·lnPi)

Simpson 指數(shù)(D)又稱(chēng)優(yōu)勢(shì)度指數(shù):

D=1-∑Pi2

Pielou均勻度指數(shù)(E)：

E=H′/lnS

豐富度指數(shù)(S)指被利用的碳源的總數(shù)，為每孔中(C-R)的值大于0.25的孔個(gè)數(shù)。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分別進(jìn)行方差分析和主成分分析；用Canoco 4.5進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用生物菌肥對(duì)桃園土壤養(yǎng)分的影響

生物菌肥對(duì)桃園土壤主要理化參數(shù)的影響見(jiàn)表1。隨生物菌肥施用量的增加，土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量呈先增加后降低趨勢(shì)。

表1 不同處理對(duì)土壤主要理化參數(shù)的影響

與CK相比，0～20 cm土層T1、T2和T3處理土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量均增加，其中T1處理土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量最高，分別增加3.08%和20.00%，但各處理間差異未達(dá)顯著水平。除T1處理外，生物菌肥處理的硝態(tài)氮含量均顯著低于CK，T2處理銨態(tài)氮含量較CK增加86.26%(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著。生物菌肥處理的土壤有效磷和速效鉀含量均高于CK，其中T3處理有效磷含量和T1處理速效鉀含量最高，較CK分別提高61.29%和277.43%(P<0.05)。

20～40 cm土層，與CK相比，生物菌肥處理土壤有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量降低，土壤pH值、銨態(tài)氮和速效鉀含量提高，其中，T1處理土壤pH值和速效鉀含量最高，較CK分別增加5.75%和265.71%(P<0.05)，且T1處理速效鉀含量與其他處理差異顯著。T3處理土壤銨態(tài)氮和有效磷含量最高，較CK分別增加53.59%和109.51%(P<0.05)。

2.2 施用生物菌肥桃園土壤微生物群落功能多樣性

2.2.1 土壤微生物平均吸光值變化特征 平均顏色變化率(AWCD)是表征土壤微生物群落對(duì)底物碳源利用強(qiáng)度的指標(biāo)，AWCD值越大表明微生物密度越大，活性越高；反之微生物密度越小，活性越低[24]。由圖1可知，不同施肥處理下0～20 cm和20～40 cm 土層AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。在24～96 h內(nèi)，AWCD值迅速增加，這說(shuō)明土壤微生物代謝能力增強(qiáng)，在培養(yǎng)96 h后，AWCD值增長(zhǎng)趨于緩慢。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，0～20 cm土層微生物活性AWCD高低依次為T(mén)2>CK>T3>T1>T4，20～40 cm土層微生物活性高低依次為T(mén)2>CK>T1>T3>T4，T2處理的AWCD值最高，說(shuō)明在此條件下，生物群落代謝最快，活性最強(qiáng)，對(duì)碳源利用能力最高。

圖1 不同施肥處理土壤微生物平均吸光值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.2.2 不同施肥處理土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)分析 選取土樣培養(yǎng)96 h數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物代謝多樣性分析，不同施肥處理對(duì)桃樹(shù)土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)影響不同，如表2所示，隨生物菌肥施用量的增加，土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)。

表2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)

0～20 cm土層，T2處理的土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)最高，較CK分別增加0.21%、5.09%和0.92%，差異不顯著。T2和T3處理土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均一性指數(shù)較T1處理分別提高0.42%、23.48%和0.42%、19.57%(P<0.05)。

20～40 cm土層，土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為T(mén)3>T2>T1>CK>T4，其中，T2和T3處理土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)度指數(shù)較CK分別提高0.22%和0.25%(P<0.05)，除T4外，生物菌肥處理間無(wú)顯著差異。T4處理的土壤微生物群落豐富度指數(shù)、均一性指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著低于其他處理，且其他處理間無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，T2處理增加土壤微生物群落多樣性指數(shù)，T4處理降低土壤微生物群落多樣性指數(shù)。

2.2.3 不同施肥處理土壤微生物對(duì)六類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度 由圖2可知，施生物菌肥處理與雞糞(CK)處理土壤微生物對(duì)Biolog-Eco板中不同類(lèi)碳源利用強(qiáng)度存在差異，隨生物菌肥施用量的增加土壤微生物對(duì)Biolog-Eco板中每一類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度呈先增加后減少趨勢(shì)。

注: PM: 聚合物; CH: 碳水化合物; PA: 酚酸類(lèi)化合物; CA: 羧酸類(lèi); AA: 氨基酸類(lèi); AM: 胺類(lèi),下同。不同字母表示在P<0.05水平下各處理差異顯著。Note: PM: polymer; CH: carbohydrate; PA: phenolic acid compound: CA: carboxylic acids; AA: amino acids; AM: amine. The same below. Different letters indicate the significant difference between different treatments (P<0.05).

0～20 cm土層，T2處理土壤微生物對(duì)羧酸類(lèi)利用強(qiáng)度最高，較CK提高22.67%(P<0.05)，T4處理對(duì)聚合物和碳水化合物利用強(qiáng)度低于其他處理，較CK分別降低31.11%和23.91%(P<0.05)。

20～40 cm土層，與CK相比，T3處理對(duì)聚合物利用強(qiáng)度提高25.00%(P<0.05)，其他處理間無(wú)顯著性差異。T2處理對(duì)碳水化合物利用強(qiáng)度較CK和T4分別提高18.06%和30.77%(P<0.05)，與T1和T3處理差異不顯著。由此表明，T2處理促進(jìn)土壤微生物對(duì)羧酸類(lèi)和碳水化合物這兩類(lèi)碳源的利用，T4處理抑制土壤微生物對(duì)六類(lèi)碳源的利用。

2.3 土壤微生物功能多樣性與土壤養(yǎng)分之間的冗余分析

如圖3所示，冗余分析結(jié)果表明各個(gè)碳源之間存在相關(guān)關(guān)系。PM與AM呈顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.69；PA、AA、CA和AM呈極顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.85、0.80和0.80；CH與PA、CA呈顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.69和0.64；PA與CA、AA呈極顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.82和0.87;有機(jī)質(zhì)與AA呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.68;pH與速效鉀呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.85。

注: OM: 有機(jī)質(zhì); AP: 速效磷; AK: 速效鉀Note: OM: organic matter; AP: available phosphorus; AK: available potassium

2.4 生物菌肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)、碳源利用強(qiáng)度及土壤養(yǎng)分三因素綜合影響主成分分析

通過(guò)主成分分析可知(表3)，0～20 cm和20～40 cm土層，第1主成分特征值的變量解釋度分別為56.19%和56.15%，是最主要的解釋變量，前3個(gè)成分特征值的變量解釋度分別為93.62%和93.57%，表明這3個(gè)成分是主要分析部分。對(duì)各處理在4個(gè)成分中進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表4)，0～40 cm土層T2得分最高，分別為2.42和1.36，說(shuō)明T2處理桃園土壤微生物多樣性指數(shù)、碳源利用強(qiáng)度及養(yǎng)分含量最高。

表3 指標(biāo)總方差分解

表4 生物菌肥對(duì)土壤微生物多樣性指數(shù)、碳源利用強(qiáng)度及土壤養(yǎng)分三因素綜合影響評(píng)價(jià)

3 討 論

3.1 生物菌肥對(duì)桃園土壤養(yǎng)分的影響

生物菌肥能夠活化土壤養(yǎng)分，提高土壤養(yǎng)分有效性。研究結(jié)果表明，施用生物菌肥能提高桃園土壤有效磷和速效鉀含量，其中生物菌肥300 kg·667m-2效果最佳?？赡芤?yàn)樯锞手卸鄶?shù)含有解淀粉芽孢桿菌等能夠活化土壤難溶性磷、鉀元素，從而提高有效磷和速效鉀含量[25]。柳曉磊等[26]研究表明，復(fù)合微生物菌與氨基酸水溶肥配施提高了土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量；叢山等[27]在番茄上的研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌肥處理均能增加土壤速效鉀和有效磷含量。本研究發(fā)現(xiàn)，隨施肥量增加土壤有效磷含量先增加后降低，其中，施肥量在1 000 kg·667m-2時(shí)，20～40 cm土層土壤有效磷含量顯著低于其他菌肥處理。王立偉等[28]在番茄上施用生物菌肥也發(fā)現(xiàn)，生物菌肥可增加土壤中有效磷和速效鉀含量，隨生物菌肥施用量的增加先增加后降低。當(dāng)施入土壤中的微生物菌劑過(guò)量時(shí)破壞了土壤中微生物的種群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響土壤中磷素的有效性，使土壤有效磷含量降低[29]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)含量隨生物菌肥施用量的增加，總體呈現(xiàn)降低，這與前人研究結(jié)果相反[30]，可能是隨生物菌肥施用量的增加，促進(jìn)了微生物對(duì)碳水化合物和氨基酸類(lèi)物質(zhì)的利用，而這類(lèi)物質(zhì)能夠產(chǎn)生正激發(fā)效應(yīng)，加速土壤中有機(jī)質(zhì)的腐解，土壤有機(jī)質(zhì)含量降低[31]。另外，施用生物菌肥較對(duì)照降低了土壤硝態(tài)氮含量，與劉繼培等[32]研究不一致，可能與土壤中碳含量有關(guān)，C/N影響土壤中氮含量的轉(zhuǎn)化[33]，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2 生物菌肥對(duì)桃園土壤微生物功能多樣性的影響

Biolog-Eco板技術(shù)是通過(guò)測(cè)定土壤微生物對(duì)若干種不同單一碳源利用方式來(lái)鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)組成，其代謝活性差異來(lái)表征微生物種群變化和多樣性。多樣性指數(shù)用來(lái)反映土壤微生物群落功能[34]。本研究發(fā)現(xiàn)隨生物菌肥用量增加，土壤微生物活性和多樣性指數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)(如表4所示)，生物菌肥用量為300 kg·667m-2時(shí)，土壤微生物活性和群落多樣性最高，隨著用量增加土壤微生物活性和群落多樣性降低。一方面可能是由于生物菌肥用量過(guò)大，改變了土壤微生物優(yōu)勢(shì)種群，促進(jìn)某些微生物種群生長(zhǎng)代謝，抑制其他微生物種群生長(zhǎng)代謝，致使某些微生物功能群與其相關(guān)的特性消失，從而降低微生物代謝活性和微生物功能多樣性[35]；另一方面可能是該生物菌肥含有豐富的解淀粉芽孢桿菌，用量過(guò)大導(dǎo)致其分泌的抗生素、抗菌蛋白等物質(zhì)抑制了真菌和其它類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)，致使土壤微生物功能多樣性減退[36]。因此，生物菌肥施用量對(duì)土壤微生物群落影響須控制在一定的范圍之內(nèi)，過(guò)多則造成浪費(fèi)，還影響其對(duì)土壤微生物效果的發(fā)揮。

本研究也表明，土壤有機(jī)質(zhì)含量與微生物對(duì)氨基酸利用強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)關(guān)系。主要因?yàn)榘被崾峭寥烙袡C(jī)質(zhì)的重要組成部分，增加土壤碳和氮含量[37]，為微生物創(chuàng)造更好生長(zhǎng)環(huán)境，從而增強(qiáng)土壤微生物對(duì)氨基酸類(lèi)化合物利用強(qiáng)度[38]，有機(jī)質(zhì)為土壤微生物提供生長(zhǎng)所需的能量和營(yíng)養(yǎng)，土壤有機(jī)質(zhì)含量與微生物群落活動(dòng)關(guān)系密切[39]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，土壤速效鉀含量隨土壤pH值增加而增加，這與楊磊等[40]和林毅等[41]的研究相似，在一定范圍內(nèi)，pH值越高，土壤速效鉀含量越高，高pH值能促使土壤速效鉀的釋放和轉(zhuǎn)移。

4 結(jié) 論

生物菌肥能夠提高新疆地區(qū)桃園土壤養(yǎng)分和土壤微生物對(duì)碳源利用的強(qiáng)度，增加土壤微生物活性和功能多樣性，其中，生物菌肥300 kg·667 m-2在改善桃園土壤養(yǎng)分以及微生物功能多樣性效果最佳。