一株鏈霉菌的分離、鑒定及其特性研究

雒曉芳，陳麗華，楊成波，徐娟娟，娜吾巴爾·阿布都黑力，趙梓彤

1西北民族大學實驗教學部；2西北民族大學化工學院，蘭州 730030；3中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院 介入治療科，蘭州 730050；4西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個或兩個以上苯環(huán)構成的稠環(huán)化合，它主要來源媒，石油，木材，煙草，有機高分子化合物等有機物不完全燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)性碳氫化合物，是環(huán)境持久性污染物中最具有代表性的一類持久性有機污染[1]。PAHs有很多種，蒽屬于其中的一種，由于PAHs有難降解性、生物毒性、生物累積性和很強的致癌性[2]，嚴重威脅著人類身體健康，因此如何除去環(huán)境中的PAHs，保證人類健康和自然環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展成為了現(xiàn)代學術領域的熱門問題。

近幾年，通過各國環(huán)境科學領域的研究和實驗表明，解決環(huán)境中多環(huán)芳烴污染物主要是通過物理[3,4]、化學[5,6]和生物[7,8]三種解決途徑。由于微生物的代謝，主要依靠自身產(chǎn)生的酶來進行，當微生物體中脫氫酶活性較高時，微生物的分解代謝能力越強，代謝效率高越高，對污染物的降解性能越好，所以目前大多數(shù)用微生物降解的方法除去環(huán)境中的污染物[9]。Fan等[10]利用微生物菌群對混合烴進行降解發(fā)現(xiàn)，該菌群對去除土壤中由環(huán)十二烷、正 十六烷和芘所構成的混合烴類污染物具有明顯的促進作用，各類污染物的降解速率均呈現(xiàn)先高后低的趨勢，與微生物多樣性、數(shù)量以及活性變化趨勢相似。Ma等[11]采用高濃度的PAHs作為環(huán)境選擇壓力，獲得了高效多環(huán)芳烴(PAHs)降解菌群，結果表明，菲菌和芘菌對高環(huán)多烴PAHs具有較強降解能力。Luo等[12]等通過采用蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)在不同溫度、pH、PAHs質量下對蒽、芘、芴的降解性能，實驗結果表明，溫度與pH交互項對蒽、芘的降解影響較顯著，溫度與PAHs質量交互對芴的降解影響較顯著。

近年來，蒽、芘、芴通常被用來研究PAHs微生物降解機制的模式化合物。本文主要是在自然界中篩選能夠對蒽進行降解的微生物[13]，并對微生物進行分離鑒定，然后分析了暗黑微綠鏈霉菌在不同溫度、pH、菌液量、鹽度條件下對蒽化合物的降解性能及脫氫酶活性，通過響應面法設計和單因素實驗的方法，以溫度、pH、濃度為自變量，降解率為因變量分析各因素之間的交互作用，找出降解蒽的最佳脫氫酶條件，為多環(huán)芳烴污染土壤的修復技術提供資源保障和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

從甘肅華慶油田油井附近地表深度為10 cm左右石油污染土壤中富集、篩選分離得到1株優(yōu)勢菌株，初步命名為Sa。

1.1.2 主要試劑

蒽(An)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、環(huán)己烷、甲苯(以上均為分析純)，活性炭(顆粒狀和粉狀)、濃硫酸(H2SO4，優(yōu)級純)

1.1.3 儀器

KRQ-400P 智能型人工氣候箱(上海 齊欣科學儀器有限公司)；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；S.SW-CJ-2F 凈化工作臺(上海躍進醫(yī)療器械廠)

1.2 鑒定方法

1.2.1 菌株鑒定

1.2.1.1 形態(tài)觀察與生理生化鑒定

在30 ℃下，將分離篩選而得的菌懸液涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，2天后觀察菌株的生長情況，記錄菌落特征。進行簡單染色，在顯微鏡下觀察該菌株的形態(tài)特征。參照《微生物學實驗(第4版)》對菌株進行生理生化鑒定。

1.2.1.2 分子生物學鑒定

以細菌總DNA為模板進行擴增，采用細菌16S rDNA PCR通用引物：8F(′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1512R(5′-ACGGCTACCTTGTCGAC TT-3′)，進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性5 min ，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴增后的產(chǎn)物寄到寶生物有限公司測序。將16S rDNA測序結果用BLAST軟件與Genbank中已登錄的16S rDNA序列進行同源性比較。用分子進化遺傳學分析與序列比對軟件MEGA5.1的鄰近相接法(Neighbor-Joining Method)對clustalx多重比對結果進行系統(tǒng)進化分析，采用Boot strap方法500個重復進行可靠性檢驗。

1.3 菌株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

將制備的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，放在121 ℃高壓滅菌15 min，備用。在無菌條件下將該菌株接種于待用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4 單因素降解率的測定

用索氏提取法測定降解率，降解時間48 h左右，取出裝置，提取瓶中吸取0.5 mL定容至50 mL，環(huán)己烷作為空白對照在紫外分光光度計290 nm處測定吸光度值，并與標準曲線作對比，計算得出殘留量和降解率，記錄數(shù)據(jù)、繪制折線圖。

1.4.1 溫度梯度設定及實驗方法

將制備好的若干樣品各加入5 mL菌液(選擇40～50 h的菌懸浮液進行降解特性研究，以下類同。設計3個重復組)，恒溫培養(yǎng)箱分別調至24、26、28、30、32 ℃進行2 h恒溫振蕩培養(yǎng)[14]。

1.4.2 pH 梯度設定及實驗方法

將制備好的菌液分為五份，用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉分別調至pH為3、5、7、9、11[15]，放入制備好的若干樣品中(設計3個重復組)，混勻放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)72 h。

1.4.3 菌液量梯度設定及實驗方法

將制備好的樣品分別加入1、3、5、7、9 mL Sa菌液(設計3個重復組)，混勻放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)72 h。

1.4.4 鹽度梯度設定及試驗方法

將制備好的菌液分為五份，用NaCl分別調至鹽度為40、80、120、160、200 mmol/L五個值。調制后分別加入制備好的若干樣品中(設計3個重復組)，混勻放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)72 h。

1.5 脫氫酶活性測定方法

將培養(yǎng)物稱取1 g于15 mL離心管，加入3 mL蒸餾水洗滌，在離心機上4 000 rpm離心3 min，倒出上清液(設計3個重復組)。再次加入3 mL蒸餾水、2 mL Tris-HCL溶液、0.5 mL TTC溶液，放置37 ℃培養(yǎng)箱24 h后取出，立即加入2滴濃硫酸終止反應。振蕩均勻并加5 mL甲苯。離心機上4 000 rpm離心3 min。甲苯作為空白對照，在紫外分光光度計486 nm處測上層紅色液體的吸光度，對比標準曲線計算出脫氫酶活性[16]。

1.6 多因素降解

在單因素實驗基礎上，選出三個最能影響蒽降解多環(huán)芳烴的因素并進行條件優(yōu)化。利用Box-Behnken 實驗設計原理以溫度，pH，菌液量3個因素為自變量，降解率為響應值設計三因素、三水平的響應面實驗，溫度分別為25、27.5、30 ℃，pH分別5.0、7.0、9.0，菌液量分別為3、5、7 g。每組實驗重復3 次。根據(jù)實驗結果,利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進行方差分析以及響應面分析，從而優(yōu)化實驗模型。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)觀察

圖1 菌株的菌落形態(tài)及染色(×1000)Fig.1 Colony morphology and staining of strain (×1000)注：石碳酸復紅染色。Note:Red staining with carbolic acid.

該菌株培養(yǎng)兩天后取出觀察，此菌生長旺盛，菌落白色，不規(guī)則圓形，呈輻射毛絨狀，表面干燥無光澤，菌落與培養(yǎng)基間連接緊密，不易挑取。顯微鏡下觀察菌絲均為絲狀，無運動性。根據(jù)Sa菌株的培養(yǎng)特征及染色后顯微鏡下形態(tài)觀察，初步推測該菌株應為鏈霉菌屬(Streptomyces)某菌種。

2.1.2 菌株的生理生化特征

各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)出的差異反映出它們具有不同的酶系和不同的生理特征，這些特性可被用作為微生物鑒定和分類的內(nèi)容。該株菌的生理化鑒定中明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、肌醇、甘露醇、蔗糖 、果糖，呈陽性，運動性、纖維素水解呈陰性，石蕊牛奶表現(xiàn)出凝固且胨化。結果表明，該株菌能利用多種糖類物質作為碳源和能源生長代謝，可分泌淀粉酶和蛋白酶，動力實驗顯示無運動性。

2.1.3 菌株生長曲線趨勢

根據(jù)生長曲線測定方法所得此菌的生長曲線數(shù)據(jù)可知，該株菌的停滯期較長，20 h之后進入對數(shù)生長期，36 h進入穩(wěn)定期，48 h后開始衰亡菌液濃度降低。

2.2 16S rDNA系統(tǒng)進化分析

將16S rDNA測序結果與Gen bank中已登錄的16S rDNA序列進行同源性比較。結果顯示，菌株Sa的16S rDNA序列與暗黑微綠鏈霉菌(Streptomycesatrovirens)的16S rDNA序列具有100%同源性。在此基礎上利用MEGA5.1的鄰近相接法構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。綜上所述，結合形態(tài)學觀察、生理生化特性及16S rDNA測序結果綜合分析，將菌株Sa菌株歸屬于暗黑微綠鏈霉菌(Streptomycesatrovirens)屬的一種。

2.3 不同溫度條件下脫氫酶活性與降解率的關系

圖2 不同溫度下蒽的脫氫酶活性與降解率Fig.2 Dehydrogenase activity and degradation rate of anthracene at different temperatures

由圖2可知，Sa在不同溫度條件下對蒽降解率與脫氫酶活性呈先增大后減小趨勢，蒽在樣品培養(yǎng)溫度達到28℃時脫氫酶活性最高，溫度高于28 ℃時降解率與脫氫酶活性隨溫度升高而下降。蒽的脫氫酶活性最高達到了86.46 μg/mL，可見溫度對酶活性有著較大的影響，低溫或高溫都會降低脫氫酶活性。因為在低溫時，細胞代謝能力較低，會使降解率降低，當溫度為28 ℃時，酶活性最高，代謝旺盛，降解率也會較高，當環(huán)境溫度過高,酶可能失活，降解率下降[17]。因此在26～28 ℃時降解效果最好，蒽的降解率高達93.86%。

2.4 不同pH條件下蒽的脫氫酶活性與降解率關系

圖3 不同pH條件下的蒽的脫氫酶活性與降解率Fig.3 Dehydrogenase activity and degradation rate of anthracene under different pH conditions

由于H+濃度影響微生物對營養(yǎng)物的吸收和生化反應，環(huán)境中pH值將會對微生物的生長具有一定的影響[18]。如圖3所示，蒽的脫氫酶活性與降解率隨著pH值的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在pH為7時蒽的脫氫酶活性與降解率達到了最高。由此可見pH對Sa降解蒽產(chǎn)生脫氫酶有較大的影響。這種現(xiàn)象與細胞酶的活性受pH值影響有關，pH值過高或過低均影響酶活性，從而降低細胞代謝速率。當處于最佳pH值時，利于酶發(fā)揮最佳活性，利于細胞對物質的代謝，故降解率最高。降解率表現(xiàn)出與脫氫酶活性同步，因此也可以判斷出二者有一定相關性。

2.5 不同菌液量下蒽的脫氫酶活性與降解率關系

圖4 不同菌液量下蒽的脫氫酶活性與降解率Fig.4 Dehydrogenase activity and degradation rate of anthracene under different bacterial liquid amounts

在環(huán)境因素固定的情況下用不同量的Sa進行降解，來測試同樣活性的菌株數(shù)量在不同的情況下對降解率的影響。由圖4可知，蒽的降解率隨著菌液量的增加不斷地增加，蒽的脫氫酶活性呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，在菌液量為5 mL時蒽的脫氫酶活性達到了62.19 μg/mL。由此得出蒽的降解率隨著菌液量的增加降解率也在增加，但總體來看變化幅度不大，增長的范圍小，變化不明顯。蒽的脫氫酶活性隨著菌液量的增加，先增加后減小，在菌液量為5 mL時活性最高。

2.6 不同鹽度件下蒽的脫氫酶活性與降解率關系

圖5 不同鹽度下蒽的脫氫酶活性與降解率Fig.5 Dehydrogenase activity and degradation rate of anthracene fluorene under different salinity

由圖5可知蒽的脫氫酶活性和降解率隨著鹽度的變化呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在120 mol/L時蒽的脫氫酶活性和降解率達到最大，脫氫酶活性和降解率變化范圍都很小，由此可見鹽度對蒽的影響不是很大。

2.7 響應面設計與分析

由單因素實驗結果可知，在溫度，pH，菌液量條件下，蒽的降解率比較好，而鹽度因素對脫氫酶活性影響不大，由此選出最能影響脫氫酶活性的因素及條件：溫度為25～30 ℃、pH為5～9、菌液量為3～7 mL，并選擇脫氫酶活性為響應值，用Design-Expert8.0軟件的Box-Behnken中心進行優(yōu)化設計。通過表1,2中對蒽脫氫酶活性的實驗結果回歸分析，得到回歸方程：

R=119.86-3.73A+5.34B+2.00C+3.63AB-3.95AC+12.09BC-16.78A2-28.97B2-31.70C2

一般顯著性水平定為0.05，即P<0.05時，才表明交互效應顯著(或說存在交互作用)，0.050.05，模型信噪為9.308 3>4，模型可取，可以用該模型做預測實驗。由表2可知該模型復相關系數(shù)為0.932 5，校正相關系數(shù)為0.845 7，表示該模型擬合了93.25%的數(shù)據(jù)，三個影響因素P值大小分別為溫度為0.355 0、pH為0.199 4、菌液量為0.612 3，該模型影響效應從大到小是：pH>溫度>菌液量。

表1 蒽脫氫酶活性的回歸模型方差分析Table 1 Anthracene dehydrogenase activity regression model analysis of variance

表2 蒽脫氫酶活性的響應面結果誤差分析Table 2 Error analysis of response surface results of anthracene dehydrogenase activity

2.8 響應面結果與分析

由圖6可知，響應面曲線走勢較平緩，但等高線呈現(xiàn)的橢圓型明顯，說明pH與溫度兩者交互作用對Sa降解蒽的脫氫酶活性有影響。若pH固定，溫度在27～28 ℃之間脫氫酶活性達到頂峰，溫度在25～27 ℃之間脫氫酶活性隨溫度上升而增強，在28～30 ℃時脫氫酶活性隨溫度下降而減弱。若溫度固定，pH在7.0～8.0時脫氫酶活性達到頂峰，pH在5.0～7.0之間脫氫酶活性隨pH升高而增強，pH在8.0～9.0之間脫氫酶活性隨pH升高而減弱。溫度在27～28 ℃，pH在7.0～8.0之時脫氫酶活性達到頂峰。

溫度與菌液量以及菌液量與pH兩者交互作用對Sa降解蒽的脫氫酶活性也有影響，但響應面趨勢圖形與圖6差別不大。若菌液量固定，溫度在27～28 ℃之間脫氫酶活性達到頂峰，溫度在25～27 ℃之間脫氫酶活性隨溫度上升而增強，在28～30 ℃時脫氫酶活性隨溫度下降而減弱。若溫度固定，菌液量在5.0 mL時脫氫酶活性達到頂峰，菌液量在3.0 ～5.0 mL之間脫氫酶活性隨菌液量增加而增強，菌液量在5.0～7.0 mL之間脫氫酶活性隨菌液量增加升高而減弱。溫度與菌液量交互作用下菌液量在5.0 mL左右，溫度在27～28 ℃之時脫氫酶活性達到頂峰。若pH固定，菌液量在5.0 mL左右時脫氫酶活性達到頂峰，菌液量在3.0～5.0 mL之間脫氫酶活性隨菌液量增加而增強，菌液量在5.0～7.0 mL之間脫氫酶活性隨菌液量增加升高而減弱。若菌液量固定，pH在7.0～8.0時脫氫酶活性達到頂峰，pH在5.0～7.0之間脫氫酶活性隨pH上升而增強，在8.0～9.0時脫氫酶活性隨pH下降而減弱。pH與菌液量交互作用下菌液量在5.0 mL左右，pH在7.0～8.0時脫氫酶活性達到頂峰。三個交互效應影響結果從大到小依次為：pH-菌液量>溫度-菌液量>溫度-pH。

圖6 溫度與pH交互影響暗黑微 綠鏈霉菌對降蒽的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of S.anthracene reduced by interaction of temperature and pH

2.9 最優(yōu)化試驗檢測

在最佳工藝條件下，進行優(yōu)化實驗檢測，降解溫度為27.23 ℃、降解pH為7.19、降解菌液量為5.11 mL，進行3次重復驗證實驗。實際測得Sa的平均脫氫酶活性為121.50 μg/mL，模型中的脫氫酶活性為120.38 μg/mL，實驗值與預期值基本相符。

3 討論

微生物代謝多環(huán)芳烴有兩種方式：一是以多環(huán)芳烴為惟一碳源；二是多環(huán)芳烴與其他有機質進行共代謝。本實驗使用第一種方式并以活性炭為吸附載體，研究溫度、pH、菌液量、鹽度對蒽的降解影響。許多微生物能以低分子量的多環(huán)芳烴(四環(huán)以內(nèi))作為唯一的碳源和能源，并將其完全礦化。然而，對于高分子量的多環(huán)芳烴，由于其化學結構的復雜性以及在水環(huán)境中的低溶解度，難以被微生物直接降解。因為研究表明,許多四環(huán)或多環(huán)且分子量較高的多環(huán)芳烴，由于其化學結構的復雜性以及在水環(huán)境中的低溶解度，難以作為惟一碳源和能源被微生物降解,而是以共代謝的方式進行[19]。

溫度和pH作為環(huán)境因素，對菌株的活性及降解污染物的效果均能產(chǎn)生影響。當環(huán)境因素達到菌株生長的最適條件時，脫氫酶活性和降解率的效果會達到最好。而本實驗單因素部分的結果也證明了，環(huán)境因素對降解率和脫氫酶活性有很大影響。多環(huán)芳烴在自然環(huán)境系統(tǒng)中多以混合物的形式存在，復雜的多底物混合狀態(tài)勢必會影響微生物的生理生態(tài)以及微生物對混合組分中單個底物的利用動力學,進而會影響降解效率。溫度對微生物降解多環(huán)芳烴的影響主要表現(xiàn)在其對多環(huán)芳烴的理化性質、化學組成、微生物對多環(huán)芳烴的代謝以及微生物群落結構等的影響。低溫下由于酶活性的降低使多環(huán)芳烴的生物降解受到抑制。此外，環(huán)境中的pH值對大多數(shù)微生物都是適合的，氣候和季節(jié)的變化對pH值會產(chǎn)生一定的影響，不同的環(huán)境中,微生物生長的最適pH值不一定相同。

菌液量作為降解微生物自身因素對多環(huán)芳烴降解起著重要作用，從本實驗的單因素及多因素結果可看出，雖然菌液量在單獨作用是效果不明顯，但其在多因素實驗中與其他因素交互作用時對脫氫酶活性影響非常顯著。當生物接種量較少時，營養(yǎng)物質充足，細菌相互之間不會出現(xiàn)抑制作用，隨著生物接種量的增加，細菌之間爭奪營養(yǎng)物質，相互之間產(chǎn)生競爭和抑制關系，故出現(xiàn)菌活性下降的現(xiàn)象[20]。

4 結論

通過形態(tài)特征和生理生化試驗指標以及16S rDNA序列及同源性比對，初步鑒定Sa為暗黑微綠鏈霉菌(Streptomycesatrovirens)的一種。通過以降解過程中蒽脫氫酶活性性為響應值，考察各自變量及自變量之間的交互作用對脫氫酶活性的影響，優(yōu)化降解脫氫酶活性與各自變量條件因素的響應關系，結果表明，單因素影響效果依次為：pH、溫度、菌液量；交互效應影響效果依次為： pH-菌液量、溫度-菌液量、溫度-pH。其中pH與菌液量交互作用P值小于0.05，其交互效應對蒽的脫氫酶活性作用顯著。