高效液相色譜法測定丁桂兒臍貼中桂皮醛和胡椒堿含量

楊曉寧 禹玉洪 劉輝 董蓉 張超

·論著·

高效液相色譜法測定丁桂兒臍貼中桂皮醛和胡椒堿含量

楊曉寧 禹玉洪 劉輝 董蓉 張超

目的建立丁桂兒臍貼中桂皮醛和胡椒堿的含量測定方法。方法采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 um)，測定桂皮醛以甲醇—水(50∶50)為流動(dòng)相，檢測波長為290 nm；測定胡椒堿以乙腈—水(45∶55)為流動(dòng)相，檢測波長為343 nm。結(jié)果桂皮醛進(jìn)樣量在0.1053～3.3696 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，胡椒堿進(jìn)樣量在0.02592～0.25920 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，它們準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性均符合要求。結(jié)論采用高效液相色譜(HPLC)法測定丁桂兒臍貼中丁香酚和胡椒堿含量，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于控制丁桂兒臍貼的質(zhì)量。

丁桂兒臍貼； 高效液相色譜； 桂皮醛； 胡椒堿； 含量測定

丁桂兒臍貼(小兒腹瀉帖)是針對兒童常見病，高發(fā)病腹瀉腹痛的預(yù)防和治療用藥，由丁香、肉桂、蓽茇組成，臨床療效好，安全無副作用。為了提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜法測定丁桂兒臍貼中有效成分桂皮醛和胡椒堿含量。

1 儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀；AB265-S電子天平(Mettler Toledo)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。桂皮醛對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號(hào)：110710-201016)，胡椒堿對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號(hào)：0775-200203)；乙腈及甲醇為色譜純(Burdick&Jackson公司)，超純水，無水乙醇為分析純。丁桂兒臍貼來源于亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)110849、110850、110851，隨機(jī)抽取連續(xù)生產(chǎn)的3批成品。

2 方法與結(jié)果

2.1 桂皮醛含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 以Agilent technologies ZORBAX SB-C18為色譜柱；以水—甲醇(50∶50)為流動(dòng)相；檢測波長為290 nm。理論板數(shù)按桂皮醛峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[1]127-128。

2.1.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備：取桂皮醛對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中加無水乙醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。(2)供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下本品10貼，除去蓋襯、背襯，剪碎，混勻，立即取樣約0.5 g，精密稱定，置具塞棕色錐形瓶中，精密加入無水乙醇50 ml，稱定重量，置冷水浴中，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30分鐘，放至室溫，再稱定重量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，濾液置冰箱中冷藏，放置過夜，濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)肉桂陰性對照溶液的制備：按處方藥味比例，去肉桂，按制備工藝制成陰性對照制劑，再按供試品溶液制備方法制備成陰性對照液。

2.1.3 準(zhǔn)確度 精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品9份，每份約0.25 g，分成3組，分別精確加入0.9477 mg/ml的桂皮醛對照品溶液0.8 ml、1 ml、1.2 ml(即含桂皮醛0.7582 mg、0.9477 mg、1.1372 mg)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測定含量。色譜條件同“2.1.1”的方法。桂皮醛的平均回收率為102.47%，RSD=0.52%，n=9。表明該法加樣回收率合格。

2.1.4 精密度 (1)重復(fù)性：實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員(A)操作，精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)下的方法。測定桂皮醛的平均含量為3.82 mg/g，RSD=1.60%，n=6。表明樣品重復(fù)性良好。(2)中間精密度試驗(yàn)：同實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)人員(B)操作，精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，使用不同的色譜柱(Agilent technologies Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，色譜柱S/N：USH016008)、不同的液相測定，色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)下的方法，并與實(shí)驗(yàn)人員(A)測定結(jié)果相比較，結(jié)果測定桂皮醛的平均含量為3.80 mg/g，RSD=1.22%，n=12。表明樣品中間精密度良好。

2.1.5 專屬性 (1)分別精密吸取肉桂陰性對照溶液、空白溶劑(無水乙醇)及流動(dòng)相各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。(2)結(jié)果：在肉桂陰性對照溶液、空白溶劑(無水乙醇)及流動(dòng)相色譜圖中，在與桂皮醛對照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間(RT=12.9～13.3分鐘)點(diǎn)，未見有色譜峰。(3)結(jié)論：陰性無干擾，本品其他藥材、溶劑及輔料不干擾本品的桂皮醛含量測定。本方法的專屬性很好，見圖1。

A：桂皮醛對照品；B：供試品溶液；C：肉桂陰性對照溶液；D：流動(dòng)相；E：空白溶劑圖1 桂皮醛含量測定專屬性HPLC色譜圖

2.1.6 線性 (1)對照品溶液的制備：精密稱取桂皮醛對照品適量，加無水乙醇制成每1 ml含1.053 mg的溶液，即得對照品儲(chǔ)備液。(2)精密量取上述對照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6 ml、3.2 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品1、2、3、4、5、6。分別精密量取10 μl，注入色譜儀，測得峰面積，以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作圖。計(jì)算得到線性回歸方程為Y=10705X+96.038(r=0.9999)，結(jié)果表明桂皮醛0.1053～3.3696 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 供試品溶液的穩(wěn)定性考察 取裝量差異項(xiàng)下本品10貼，除去蓋襯，剪碎，混勻，取約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別在制備后0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)樣。在24小時(shí)內(nèi)測得桂皮醛平均峰面積為3957.92，RSD=0.47%，表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 樣品的桂皮醛含量測定 分別測定本公司三批丁桂兒臍貼成品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)下的方法，測定桂皮醛含量，結(jié)果見表1。

表1 三批樣品桂皮醛含量測定結(jié)果(n=4)

2.2 胡椒堿含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 以Waters X Bridge C18為色譜柱；以乙腈—水(45∶55)為流動(dòng)相；檢測波長為343 nm。理論板數(shù)按胡椒堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[1]219。

2.2.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備：取胡椒堿對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中加無水乙醇制成每1 ml含12 μg的溶液，即得。(2)供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下本品10貼，除去蓋襯、背襯，剪碎，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置100 ml棕色量瓶中，加入無水乙醇90 ml，密塞，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30分鐘，放至室溫，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，置冰箱中冷藏，放置過夜，濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)蓽茇陰性對照溶液的制備：按處方藥味比例，去蓽茇，按制備工藝制成陰性對照制劑，再按供試品溶液制備方法制備成陰性對照液。

2.2.3 準(zhǔn)確度 精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品9份，每份約0.25 g，分成3組，分別精確加入0.5702 mg/ml的胡椒堿對照品溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml(即含胡椒堿0.4562 mg、0.5702 mg、0.6843 mg)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測定含量。色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)下的方法。胡椒堿的平均回收率為100.46%，RSD=1.43%，n=9。表明該法加樣回收率合格。

2.2.4 精密度 (1)重復(fù)性：由實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員(A)操作，精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品6份，每份約0.5 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測定含量。色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)下的方法。測定胡椒堿的平均含量為2.15 mg/g，RSD=0.71%，n=6。表明樣品重復(fù)性良好。(2)中間精密度：由同實(shí)驗(yàn)室不同實(shí)驗(yàn)人員(B)操作，精密稱取裝量差異項(xiàng)下同一批本品6份，每份約0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，使用不同的色譜柱(Agilent，SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，色譜柱S/N：USCL032313)、不同的液相(Agilent 1200高效液相色譜儀，編號(hào)：4號(hào))測定，色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)下的方法，并與實(shí)驗(yàn)人員(A)測定結(jié)果相比較。結(jié)果測定胡椒堿的平均含量為2.15 mg/g，RSD=0.26%，n=12。表明樣品中間精密度良好。

2.2.5 專屬性 (1)分別精密吸取蓽茇陰性對照溶液、空白溶劑(無水乙醇)及流動(dòng)相各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。(2)結(jié)果：在蓽茇陰性對照溶液、空白溶劑(無水乙醇)及流動(dòng)相色譜圖中，在與蓽茇對照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間(RT=13.5～13.9分鐘)點(diǎn)，未見有色譜峰。(3)結(jié)論：陰性無干擾，本品其他藥材、溶劑及輔料不干擾本品的胡椒堿含量測定，本方法的專屬性很好，見圖2。

A：胡椒堿對照品；B：供試品溶液；C：蓽茇陰性對照溶液；D：流動(dòng)相；E：空白溶劑圖2 胡椒堿含量測定專屬性HPLC色譜圖

2.2.6 線性 (1)對照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對照品適量，加無水乙醇制成每1 ml含0.864 mg的溶液，即得對照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對照品溶液3 ml至100 ml量瓶，無水乙醇定容，搖勻，即得對照品濃度為0.02592 mg/ml的對照品儲(chǔ)備液。(2)精密量取濃度為0.02592 mg/ml的對照品儲(chǔ)備液1.0 ml、3.0 ml、5.0 ml、7.0 ml、9.0 ml、10.0 ml，分別置10 ml棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品1、2、3、4、5、6。分別精密量取10 μl，注入色譜儀，測得峰面積，以對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作圖。計(jì)算得到線性回歸方程為Y=66613X-3.8247(r=0.9999)，結(jié)果表明胡椒堿0.02592～0.25920 μg范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 供試品溶液的穩(wěn)定性考察 本次試驗(yàn)考察了供試品溶液的穩(wěn)定性，方法如下：取裝量差異項(xiàng)下下本品10貼，除去蓋襯，剪碎，混勻，取約0.5 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別在制備后0小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)樣。在24小時(shí)內(nèi)測得胡椒堿平均峰面積為820.9，RSD=0.44%。表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 樣品的胡椒堿含量測定分別測定 本廠三批丁桂兒臍貼成品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測定胡椒堿含量，結(jié)果見表2。

表2 三批樣品胡椒堿含量測定(n=4)

3 討論

桂皮醛含量測定流動(dòng)相考察了乙腈—水[1]127-128、甲醇—水系統(tǒng)，結(jié)果乙腈—水系統(tǒng)為流動(dòng)相桂皮醛峰拖尾，而甲醇—水系統(tǒng)為流動(dòng)相桂皮醛峰拖尾因子符合規(guī)定，最后根據(jù)保留時(shí)間、拖尾因子、分離度等因素，確定流動(dòng)相選擇甲醇—水(50∶50)。胡椒堿含量測定流動(dòng)相選擇參照2010版《中華人民共和國藥典》一部蓽茇[1]219含量測定項(xiàng)下流動(dòng)相甲醇—水系統(tǒng)，并考察了乙腈—水系統(tǒng)[2]。由試驗(yàn)結(jié)果可知流動(dòng)相乙腈—水(45∶55)，保留時(shí)間合適，分離度大于1.5，拖尾因子略超出0.95～1.05，理論板數(shù)大于3000，胡椒堿峰能夠得到很好的分離，且峰型較好，故流動(dòng)相選擇乙腈—水(45∶55)。

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(一部)[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：127-128，219.

[2] 邰臺(tái)川，彭霞. RP-HPLC法測定傣藥辣藤中胡椒堿的含量[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志，2008，14(2)：50-52.

(本文編輯：董歷華)

DeterminationofcinnamaldehydeandpiperineinDingguierUmbilicalPastebyHPLC

YANGXiao-ning,YUYu-hong,LIUHui,etal.

YaobaoPharmaceuticalgroup,Beijing101111,China

YANGXiao-ning,E-mail：yn3528@126.com

ObjectiveTo establish a method for the determination of cinnamaldehyde and piperine in Dingguier Umbilical Paste.MethodsDetermination of Cinnamaldehyde：The C18 column (4.6 mm×250 mm，5 um)was used with the mobile phase of methanol-water (50∶50). The detection wave-length was 290 nm.Determination of piperine：The C18 column (4.6 mm×250 mm，5 um)was used with the mobile phase of acetonitrile-water (45∶55). The detection wave-length was 343 nm.ResultsCinnamaldehyde had the good linearity in the range of 0.1053～3.3696 μg(r=0.9999). Piperine had the good linearity in the range of 0.02592～0.25920 μg(r=0.9999).ConclusionThe method is proved to be simple,accurate and reliable,which can be used to control the quality of Dingguier Umbilical Paste.

Dingguier Umbilical Paste； High performance liquid chromatography； Cinnamaldehyde； Piperine； Content determination

國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2011ZX09201-201-35)；山西省自然科學(xué)基金(2011011035-5)

101111 北京，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司北京藥物研究院

楊曉寧(1977- )，女，碩士，工程師。研究方向：中藥新藥研發(fā)。E-mail：yn3528@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn. 1674-1749.2014.01.004

2013-10-12)