酵母菌高糖脅迫機(jī)制的研究進(jìn)展

雷夢琳 ，李湘鑾，白衛(wèi)東*，趙文紅，劉功良，郭 波，黃文彪

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東石灣酒廠集團(tuán)有限公司，廣東佛山 528031；3.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東佛山 528511）

耐高糖酵母是一種在高糖環(huán)境中能生長、發(fā)酵產(chǎn)生乙醇和二氧化碳的真菌，其轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，發(fā)酵效率高，能適應(yīng)高滲的惡劣環(huán)境[1-3]。在高糖脅迫下，細(xì)胞內(nèi)也會產(chǎn)生過量的活性氧和活性氮等，這些有害物質(zhì)的產(chǎn)生使一氧化氮合酶被激活，進(jìn)而生成過氧亞硝基，過氧亞硝基會破壞機(jī)體，使細(xì)胞損傷[4]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，常能發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的組成會發(fā)生改變，水分活度的改變會使細(xì)胞膜破裂，也抑制了細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，這對酵母發(fā)酵有不利影響，不僅使酵母生長延緩，還會降低其發(fā)酵效率和發(fā)酵產(chǎn)量。這是由于酵母在發(fā)酵初期處于一個(gè)高糖的環(huán)境，在高糖環(huán)境下發(fā)酵會不斷產(chǎn)生乙醇，壓力不斷增大，導(dǎo)致對細(xì)胞的毒害作用增強(qiáng)[5-6]，使酵母獲得高糖耐受力，對減少高糖環(huán)境中對酵母生長的不利因素、降低對細(xì)胞的毒害作用和提高酵母發(fā)酵效率具有重要意義。

本文對耐高糖酵母進(jìn)行代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究，更深刻了解耐高糖酵母的脅迫機(jī)制，對定向改造酵母菌的性能和釀酒工業(yè)具有重要意義。

1 耐高糖酵母的篩選

1.1 自然篩選

菌種在自然環(huán)境條件下，不需要人為手段改造而通過長時(shí)間的變異、進(jìn)化，從而改變自身性能來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，得到人們想要具有某種性能的菌株就是自然篩選。自然篩選的一般步驟是先尋找初始菌株，再對初始菌株進(jìn)行培養(yǎng)，富集到一定程度后分離菌種，最后鑒定是否具有研究所需的某種性能[7]。

杜鵑等[8-9]從東北椴樹蜜發(fā)現(xiàn)一株耐高糖酵母，富集后進(jìn)行分離得到酵母菌YMI-37，對其進(jìn)行生理形態(tài)分析、基因組測序等發(fā)現(xiàn)酵母菌YMI-37為酵母菌屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。該酵母能適應(yīng)80%高糖濃度的環(huán)境，測得其初始發(fā)酵速度快，發(fā)酵效率高。LIU G L等[10]在17個(gè)陳舊蜂蜜樣品中，富集培養(yǎng)后分離純化得到了6株蜂蜜接合酵母，均屬于耐高糖酵母菌。邱巨香等[11]經(jīng)過對中蜂蜜和意蜂蜜的分離、純化、菌種鑒定，結(jié)果顯示，中蜂蜜和意蜂蜜中的耐高糖酵母都是魯氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）。吳啟鳳等[12]從貴州水晶葡萄中分離純化后得到性能較優(yōu)的菌株SJJM-7和SJJM-18，對這兩株菌株的性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在50%的高糖模擬葡萄汁培養(yǎng)基中檢出菌株SJJM-7和SJJM-18，說明這兩株菌株均具有耐高糖性能。目前，自然篩選的耐高糖酵母菌株大多數(shù)來自高濃度糖環(huán)境如蜂蜜、果汁、甘蔗、高糖果酒等，能在高糖環(huán)境下存活的酵母一般具有耐高糖性能。

1.2 誘變育種

誘變育種是一種現(xiàn)代育種技術(shù)，它利用物理、化學(xué)因素對動植物進(jìn)行處理，誘導(dǎo)其遺傳特性發(fā)生突變，再從發(fā)生突變的樣品中選擇符合人們意愿的菌株，對其進(jìn)行進(jìn)一步富集培養(yǎng)獲得新品種或種質(zhì)的育種方法。誘變育種的一般步驟：自然篩選→富集培養(yǎng)菌種分離→菌種純化→人工誘變→逐級篩選→性能鑒定[13]。根據(jù)誘變的方式，可分成紫外線誘變和自然馴化。

1.2.1 紫外線誘變

紫外線誘變法是一種被大多數(shù)人認(rèn)可的誘變育種方法，該方法對酵母菌先進(jìn)行分離篩選后再誘變，其操作方便，容易使酵母菌發(fā)生正突變。陳英[14]對野生釀酒酵母菌株MF02進(jìn)行紫外誘變，將發(fā)生突變的菌株涂布到Y(jié)P40培養(yǎng)基中，將1株來自30 s誘變時(shí)間突變體庫的菌株和1株來自45 s誘變時(shí)間突變體庫的菌株一同放在50 mL的YP40培養(yǎng)基中發(fā)酵，測其生長曲線和酒精含量，發(fā)現(xiàn)來自30 s突變體庫的突變菌株UV02_HG性能較優(yōu)，其在40%葡萄糖壓力下仍能快速生長、高速發(fā)酵。徐日益等[15]以釀酒酵母AS2.1189為初始菌株，對其進(jìn)行紫外誘變，誘變到100代后得到兩株菌株B2和A17，均能適應(yīng)高滲環(huán)境。潘慧麗等[16]以蜂蜜、葡萄、面包3種原料進(jìn)行酵母菌富集菌株，通過梯度馴化與紫外誘變相結(jié)合的手段選育耐高糖且發(fā)酵特性優(yōu)良的酵母菌株，最終獲得具有耐高糖性能的酵母菌株FM-1.1-40，其最大耐受糖度為40%。

1.2.2 自然馴化

自然馴化是可操作性強(qiáng)，方向性明確的篩選方法。熊雅蘭等[17]通過對野生型甘蔗糖蜜發(fā)酵高產(chǎn)乙醇菌株MF1002的呼吸突變菌株MF15C進(jìn)行馴化，發(fā)現(xiàn)菌株MF15C比MF1002更加適應(yīng)高糖環(huán)境。黃星源等[18]對青梅酒酵母S05進(jìn)行耐高糖馴化中，在總糖為200～300 g/L青梅清汁中都能在9～19 h較快啟動發(fā)酵，發(fā)酵第15天時(shí)，酒精度可以達(dá)到16.8%vol，殘?zhí)呛繛?.5 g/L。

1.3 基因工程育種

誘變育種的篩選工作量大，突變具有不穩(wěn)定性和多樣性，效率較低。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，基因工程育種漸漸成為常見的篩選方法，該方法可操作性強(qiáng)，目的明確。基因工程育種是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，對菌種進(jìn)行改造獲得人們意愿的性能。

沈玉平[19]通過在god基因前端插入α-淀粉酶信號肽序列，α-淀粉酶信號能在胞外分泌，插入目的基因后酶能夠高效分泌到胞外，酶活性發(fā)生改變，從而得到能在高糖環(huán)境，高溫條件下發(fā)酵的菌株。張曉陽等[20]通過代謝工程與全基因組重組得到了抗逆高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母。王立光等[21]利用同源重組法得到了NHX1基因缺失突變株，對NHX1基因的逆境脅迫性能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NHX1基因是重要的離子反向轉(zhuǎn)運(yùn)體，缺失NHX1基因會使釀酒酵母BJ3505的抗逆性降低。

2 高糖脅迫應(yīng)激代謝特性

隨著釀酒技術(shù)的進(jìn)步和釀酒工業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)外對耐高糖酵母的代謝途徑和代謝產(chǎn)物已有較多研究成果，大多數(shù)認(rèn)為細(xì)胞通過主動調(diào)節(jié)甘油、海藻糖等物質(zhì)的分泌量來應(yīng)對高糖環(huán)境。由于其代謝途徑的復(fù)雜性和代謝產(chǎn)物的多樣性，目前國內(nèi)外對于耐高糖酵母具體的代謝特性和應(yīng)答機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

蜂蜜接合酵母6-7431對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力較強(qiáng)，劉功良等[22]研究其在高糖脅迫下的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下釀酒酵母甘油的分泌量會增加，在不超過700 g/L糖質(zhì)量濃度的環(huán)境中可以調(diào)節(jié)滲透壓，可能是在高糖脅迫下由于在此范圍內(nèi)合成甘油的基因和海藻糖合成基因的表達(dá)量增加所致[23]。海藻糖是耐高糖酵母發(fā)酵過程中的一種生物相容性溶質(zhì)，細(xì)胞通過主動調(diào)節(jié)海藻糖分泌量來適應(yīng)高糖環(huán)境，保護(hù)其免受高糖脅迫環(huán)境對細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等大分子物質(zhì)的破壞[24-25]。甘油是耐高糖酵母發(fā)酵過程中的一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，甘油內(nèi)的羥基使其具有良好的親水性，能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保護(hù)細(xì)胞免受因滲透壓的改變而導(dǎo)致細(xì)胞的破壞[26-27]。三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）代謝中間產(chǎn)物對酵母在高糖環(huán)境下應(yīng)激反應(yīng)具有重要的影響，糖酵解和磷酸戊糖途徑中相關(guān)酶蛋白增加[28]，導(dǎo)致乙酰輔酶A更多地進(jìn)入到TCA中。在高糖環(huán)境中，釀酒酵母在發(fā)酵過程中由于TCA中斷，有氧呼吸受到抑制，不斷積累的α-酮戊二酸和蘋果酸等TCA中間產(chǎn)物會降低發(fā)酵效率[29]。

時(shí)桂芹等[30]以釀酒酵母為模型，對不同葡萄糖濃度的四組釀酒酵母細(xì)胞（20 g/L葡萄糖組、40 g/L葡萄糖組、60 g/L葡萄糖組和80 g/L葡萄糖組）培養(yǎng)4～8 h，隨著環(huán)境脅迫的進(jìn)行，海藻糖積累量先升高后下降，海藻糖積累量最高點(diǎn)出現(xiàn)在8 h。在不同葡萄糖濃度脅迫下，酵母細(xì)胞胞內(nèi)外甘油的積累隨著時(shí)間增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但是胞內(nèi)甘油的積累量在80 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到最高，而胞外甘油的積累量在60 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到最高。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在高糖脅迫下甘油和海藻糖是釀酒酵母的主要相容性溶質(zhì)。當(dāng)釀酒酵母在葡萄糖含量達(dá)到80 g/L的高糖環(huán)境時(shí)，酵母生長緩慢，細(xì)胞出現(xiàn)高糖脅迫，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性均顯著增高（P＜0.05），說明細(xì)胞通過調(diào)節(jié)這些抗氧化物酶的活性來維持細(xì)胞正常的滲透壓。耐高糖酵母代謝過程中與不同酶的活性有著密不可分的聯(lián)系，酶類是細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)的重要物質(zhì)，將代謝應(yīng)激物和酶類聯(lián)系在一起，在TCA、糖酵解和磷酸戊糖途徑等代謝途徑中檢測酶活力和代謝產(chǎn)物的種類、含量和代謝特性，建立清晰的代謝網(wǎng)絡(luò)以便更深刻地認(rèn)識酵母耐高糖應(yīng)激機(jī)制。

3 酵母菌耐受高糖機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究

酵母菌耐受高糖機(jī)制與胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)在酵母耐受高糖機(jī)制上的應(yīng)用越來越熱門，主要是通過對不同生長階段耐高糖酵母菌轉(zhuǎn)錄組的測序和蛋白質(zhì)合成來研究與其有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)，從而綜合分析進(jìn)一步了解具體的酵母耐受機(jī)制。陳英[14]對40%葡萄糖壓力下菌株MF02和UV02_HG的表達(dá)差異基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集，發(fā)現(xiàn)在高糖壓力下兩菌株間的表達(dá)差異主要集中在核糖體、氧化磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、硫胺素代謝、吞噬體和胞吞作用、蛋白輸出、糖代謝途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。

3.1 從轉(zhuǎn)錄水平研究酵母耐受高糖機(jī)制

吳靜等[31]研究發(fā)現(xiàn)，光滑球擬酵母（Candida glabrata）的基因CgASG1缺失會降低對氧化脅迫和高滲脅迫的抵御能力。此前研究了缺失CgASG1基因?qū)饣驍M酵母轉(zhuǎn)錄組水平的影響，C.glabrata中的轉(zhuǎn)錄因子Asg1p能維持生物魯棒性，但其不參與細(xì)胞利用非發(fā)酵性碳源這個(gè)過程，缺失基因CgASG1光滑球擬酵母對高酸的耐受力較弱。這是因?yàn)樵诟咚岘h(huán)境下ATPase活性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了改變，細(xì)胞胞內(nèi)質(zhì)子數(shù)量增加，酸性增強(qiáng)導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高[32]，進(jìn)一步影響了胞內(nèi)的代謝系統(tǒng)[33]，氧化還原相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化影響胞內(nèi)氧化還原電勢，進(jìn)而改變細(xì)胞生長[34]。葉美玲[35]對南極酵母AN5不用銅離子處理和銅離子處理的兩組酵母菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的測序，整理分析測序數(shù)據(jù)后，找出相關(guān)差異基因，對其進(jìn)行功能分析。檢測南極酵母AN5在重金屬脅迫下基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)是否明顯，并從差異基因中找到可能起明顯作用的三個(gè)基因，再設(shè)置實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明在銅離子脅迫下，基因GST和WD重復(fù)蛋白的表達(dá)量有所上調(diào)，推測這兩個(gè)基因可能與酵母菌耐受機(jī)制有關(guān)。

3.2 從蛋白質(zhì)水平研究酵母耐受高糖機(jī)制

陳英[14]對突變菌株的耐高糖性研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程途徑上的分子伴侶基因SSA1（+2.4）、SSA3（+3.7）、SSA4（+2.3）、SSB2（+1.8）、SCJ1（+2.4）、HSP42（+2.3）、CNE1（+1.8）和PDI1（+2.0）全部表達(dá)上調(diào)。在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的熱激蛋白負(fù)責(zé)蛋白折疊和分泌，作為分子伴侶參與細(xì)胞多種壓力的應(yīng)激[36]。鈣網(wǎng)蛋白（CNE1）在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上，作為分子伴侶參與糖蛋白合成和蛋白折疊[37-38]。可見突變菌株的耐高糖性狀和蛋白質(zhì)加工中的分子伴侶有著密切聯(lián)系。

田一雄等[39]采用二維電泳技術(shù)對脈沖電場處理前后哈密瓜汁中釀酒酵母蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中硫氧還蛋白過氧化物酶表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的自我防御需要該酶的調(diào)節(jié)，說明脈沖電場（pulsed electric field，PEF）處理過程中釀酒酵母細(xì)胞啟動代謝調(diào)控來應(yīng)對環(huán)境的變化。延長因子2也發(fā)生了表達(dá)上調(diào)，該因子在蛋白質(zhì)合成過程中起到重要作用，說明經(jīng)PEF處理，釀酒酵母細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境的變化，細(xì)胞需要更多的蛋白質(zhì)。

4 酵母菌耐受高糖機(jī)制的基因組學(xué)研究

耐高糖酵母的基因耐受機(jī)制近年來備受學(xué)者關(guān)注，隨著基因技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于酵母基因耐高糖機(jī)制可以通過DNA提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，比對基因庫等對其進(jìn)行基因測序，找出與其相關(guān)的基因，通過敲除這些基因，與未敲除的對照組進(jìn)行對比，研究其在高糖環(huán)境下的發(fā)酵性能，檢測基因表達(dá)水平等來進(jìn)一步驗(yàn)證耐高糖酵母的作用基團(tuán)。

4.1 GPD2、SUC2和HXT1基因表達(dá)水平對高糖脅迫下槲皮素處理酵母的影響

徐曉丹等[40]以釀酒酵母S288c為模型，分析高糖脅迫下槲皮素對其胞內(nèi)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母S288c中GPD2基因表達(dá)量相對對照組下降了45.30%，SUC2基因表達(dá)量相對對照組下降了51.30%，而HXT1基因相對表達(dá)量比對照增加了7.54倍，GUT1基因相對表達(dá)量與對照組相比基本持平。可見高糖脅迫下用槲皮素處理，GPD2和SUC2基因的表達(dá)會受到抑制，HXT1基因表達(dá)上調(diào)，所以GPD2、SUC2和HXT1基因的表達(dá)水平上調(diào)能提高釀酒酵母S288c的發(fā)酵效率。

4.2 敲除STE12、TUP1基因后對突變菌株UV02_HG的影響

陳英[14]對突變菌株UV02_HG中敲除STE12基因后，敲除菌株的細(xì)胞膜通透性降低，但其較菌株UV02_HG更能適應(yīng)高糖環(huán)境?；蚧匮a(bǔ)表達(dá)后菌株細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的透性有所增強(qiáng)，由此判斷STE12基因可能與細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的通透性有關(guān)，從而進(jìn)一步調(diào)控自身適應(yīng)高糖環(huán)境。而基因TUP1缺失后，菌株UV02_HGΔTUP1與菌株UV02_HG相比，在酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基中生長緩慢，相對呼吸強(qiáng)度較弱，基因回補(bǔ)表達(dá)的菌株UV02_HGΔTUP1在YPD培養(yǎng)基中的生長和相對呼吸強(qiáng)度都有所恢復(fù)。推測TUP1基因參與調(diào)控細(xì)胞呼吸相關(guān)的基因來維持酵母細(xì)胞的正常生長，菌株UV02_HGΔTUP1對高糖的耐受能力増強(qiáng)，由此推斷TUP1基因缺失后，細(xì)胞的呼吸作用削弱，通過對糖類物質(zhì)的利用改變細(xì)胞膜透性，從而使細(xì)胞具有高糖耐受性。

4.3 GPD2基因和tdcD基因?qū)湍傅挠绊?/h3>

工業(yè)釀酒酵母中GPD2基因與甘油合成途徑密切相關(guān)，黃廣慶[41]用工業(yè)釀酒酵母AS2.489為起始菌株，敲除GPD2基因，再通過單倍體融合來得到二倍體的GPD2基因缺失菌。用20 g/L的葡萄糖進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲除GPD2基因后的缺失菌株與起始菌株相比，甘油含量和乙酸含量都有一定程度的下降，乙醇含量有所提高。推測GPD2基因與合成甘油途徑相關(guān)，合成甘油途徑的受阻會進(jìn)一步影響發(fā)酵速率和發(fā)酵周期。孟剛等[42]為控制乙酸溢流，在乙酸代謝途徑中敲除了丙酸激酶編碼基因tdcD，該基因具有乙酸激酶活性。通過設(shè)置“微糖”和“高糖”兩個(gè)發(fā)酵環(huán)境的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，檢測在不同糖濃度條件下乙酸含量的變化和對酵母菌的影響。發(fā)現(xiàn)敲除了tdcD基因的酵母菌在高糖環(huán)境下，在對數(shù)生長后期依然發(fā)酵旺盛，產(chǎn)酸效率高，色氨酸產(chǎn)量較對照組高，而產(chǎn)乙酸量較對照組低，推測tdcD基因與酵母菌高糖耐受機(jī)制有一定相關(guān)性。

5 結(jié)論與展望

隨著分子生物學(xué)與基因工程的迅速發(fā)展[43]，越來越多學(xué)者從代謝組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)來研究酵母菌高糖耐受機(jī)制。代謝組學(xué)上，可以檢測耐高糖菌株的代謝應(yīng)激產(chǎn)物和與代謝途徑相關(guān)的酶類，了解其代謝途徑和生理特性，建立清晰的代謝網(wǎng)絡(luò)?；蚪M學(xué)上，可以對表型差異大的菌株進(jìn)行高糖脅迫處理，跟蹤脅迫前后相關(guān)基因的表達(dá)，深入研究其表達(dá)特性，找到耐受機(jī)制的關(guān)鍵基因，對定向改造酵母菌具有重大意義。轉(zhuǎn)錄組學(xué)上，可以通過對相關(guān)基因的敲除菌株和回補(bǔ)菌株進(jìn)行研究，找到轉(zhuǎn)錄因子對耐受機(jī)制的影響。蛋白質(zhì)組學(xué)上，可以通過對重要酶類進(jìn)行研究，進(jìn)一步揭示耐高糖酵母的蛋白合成。