地黃RgCDPK基因的克隆與表達(dá)分析

原增艷 宋小鋒 朱畇昊

摘?要：鈣依賴(lài)型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是高等植物細(xì)胞中重要的鈣離子信號(hào)受體，在植物抵御逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該研究以地黃為材料，設(shè)計(jì)特異引物，克隆地黃RgCDPK基因全長(zhǎng)序列，并使用在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行組織特異性分析。結(jié)果表明：（1）克隆得到的地黃CDPK基因長(zhǎng)度為1 770 bp，編碼589個(gè)氨基酸;（2）多序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含有鈣依賴(lài)蛋白激酶典型結(jié)構(gòu)域絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)及EF-手性區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明其與擬南芥 AtCDPK28 的同源關(guān)系最近，因此命名為RgCDPK（Genbank登錄號(hào)為MT024235）;（3）組織特異性分析得出RgCDPK在地黃葉中表達(dá)量最高。該研究成功克隆出地黃CDPK基因，且發(fā)現(xiàn)該基因在不同組織中的表達(dá)存在差異，為以后深入研究CDPK在地黃連作障礙等生物及非生物脅迫中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地黃， 鈣依賴(lài)蛋白激酶， 生物信息學(xué)， 組織特異性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）12-1816-08

Abstract：Calcium-dependent protein kinases （CDPKs） are important calcium sensors in higher plants， which play an important role in plant resistance to envirenment stress.In this study， a full-length cDNA of RgCDPK gene was cloned from Rehmannia glutinosa.Meanwhile， the bioinformatics analysis was used the online software， quantitative real-time PCR technique was used to detect RgCDPK expression level in different tissues.The results were as follows：（1）The full-length cDNA sequence of RgCDPK gene was 1 770 bp and encoded 589 amino acid residues; （2） Multiple sequence alignments and structural analysis revealed that its protein contained serine/threonine protein kinase region and EF-hand region， which were typical domains of calcium-dependent protein kinase.Phylogenetic analysis showed the highest similarity with Arabidopsis AtCDPK28.Thus， the gene was defined as RgCDPK （Genbank accession No.MT024235）; （3）The expression analysis of RgCDPK in different tissues revealed that high transcript levels occurred at leaves.In this study， the CDPK gene of R.glutinosa was successfully cloned， and the expression of the gene in different tissues was found to be different.The results of this study provide theoretical basis for further study on the function of CDPK in biotic， abiotic stresses and continuous cropping obstacles.

Key words：Rehmannia glutinosa， calcium-dependent protein kinase， bioinformatics， tissue specificity

Ca2+ 是植物細(xì)胞中重要的第二信使，當(dāng)一些刺激信號(hào)使胞內(nèi)Ca2+濃度增加至閾值時(shí)，產(chǎn)生信號(hào)并傳遞。鈣依賴(lài)型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是一種普遍存在的蛋白激酶，當(dāng)CDPK與Ca2+結(jié)合后，CDPK被活化發(fā)揮作用（Guo et al.， 2019）。CDPK在植物響應(yīng)高溫、干旱、紫外線等非生物脅迫和內(nèi)生菌、蟲(chóng)害等生物脅迫中起重要作用，同時(shí)，CDPK也在植物的生長(zhǎng)與發(fā)育、胞內(nèi)激素調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮重要作用（Romeis et al.，2000; Geiger et al.，2010）。CDPK基因具有4 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，依次分別為N 末端的可變區(qū)、催化區(qū)、自抑制區(qū)和調(diào)控區(qū)。調(diào)控區(qū)一般含有多個(gè)Ca2+ 結(jié)合的EF 手型結(jié)構(gòu)（EF-hand）。Ca2+與EF-hand結(jié)合后， CDPK空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致自抑制區(qū)的抑制作用解除，促使CDPK 恢復(fù)其蛋白激酶活性，進(jìn)而磷酸化下游調(diào)控因子，將信號(hào)傳遞至下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而完成對(duì)信號(hào)的響應(yīng)（Hetherington et al.，1982; Harmon et al.，1987）。CDPK在植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等組織中廣泛分布。通過(guò)基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥、水稻、玉米基因組中分別有34、31和40個(gè)CDPK基因（武志剛等，2018）。多種藥用植物如鐵皮石斛（盛況等，2017）、天山雪蓮（田曉涵等，2016）和龍血樹(shù)（張浩等，2010）中的CDPK基因也已被克隆，但地黃CDPK基因克隆的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

地黃為玄參科植物地黃屬植物地黃（Rehmannia glutinosa）的新鮮或干燥塊根，具有清熱生津、涼血止血、滋陰補(bǔ)血等功效（李慧芬，2014）。地黃栽培歷史悠久，歷代名醫(yī)對(duì)優(yōu)質(zhì)地黃產(chǎn)地的認(rèn)識(shí)幾經(jīng)變遷，自明朝以來(lái)，即確立了懷慶地黃的道地地位。懷地黃具有悠久的藥用歷史，用藥需求不斷增加，但是在栽培生產(chǎn)上，地黃具有嚴(yán)重的連作障礙，每茬收獲后需要8～10 a后才能復(fù)種（劉紅彥等，2006）。張重義等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，地黃可能依賴(lài)鈣離子信號(hào)系統(tǒng)傳遞自毒物質(zhì)信號(hào)，導(dǎo)致連作危害，其中CDPK家族基因在其中也發(fā)揮了重要作用。楊楚韻等（2017）在地黃中鑒定出了21個(gè)可能參與連作地黃鈣信號(hào)感知、傳導(dǎo)和響應(yīng)連作脅迫進(jìn)程的CDPK家族基因，但并未對(duì)其進(jìn)行克隆及表達(dá)分析。本課題組前期進(jìn)行了地黃組培苗的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，從中查找到1 條新的編碼鈣依賴(lài)性蛋白激酶的基因，并通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因序列完整。本研究分析了該基因編碼蛋白的理化特性、結(jié)構(gòu)特征和亞細(xì)胞定位，檢測(cè)了其在不同組織中的表達(dá)特性，以期為深入研究其在地黃連作障礙等生物及非生物脅迫中的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

材料取自河南中醫(yī)藥大學(xué)植物園，經(jīng)朱畇昊副教授鑒定為玄參科地黃（Rehmannia glutinosa）。所用地黃品種為“沁懷”，在6月份地黃開(kāi)花時(shí)，挖取地黃植株整株，洗凈后分別取根、葉、花組織，用錫紙包好，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)使用。

1.2 RNA的提取及cDNA 的合成

取新鮮地黃葉片、根、花瓣各0.1 g，在液氮中速凍，用TRIzol 試劑（Thermo Fisher Scientific）提取RNA。RNA使用1%瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)純度，檢測(cè)合格后用于后續(xù)cDNA的合成。取7 μL RNA 使用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]合成cDNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 地黃CDPK基因的克隆

以地黃組培苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中一條注釋為CDPK的unigene全長(zhǎng)序列為參考序列，使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物，具體見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，具體組分如下：模板cDNA 2.0 μL、2×Es Taq mix 10 μL、上下游引物（RgCDPK-F，RgCDPK-R）各1.0 μL、其余用ddH2O 補(bǔ)足。反應(yīng)程序設(shè)計(jì)如下：95 ℃，3 min;95 ℃，45s，58 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，純化回收得到目的片段，使用pMD19-T 載體進(jìn)行目的片段的連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后篩選白斑，菌液經(jīng)PCR 驗(yàn)證后送至生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.4 地黃CDPK基因的生物信息學(xué)分析

使用ORF Finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html） 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框查找;使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列的同源性搜索;使用Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html） 預(yù)測(cè)蛋白的分子量等理化性質(zhì);使用在線軟件SinalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)分析蛋白信號(hào)肽;使用TMpred（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū);使用NPSA server（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu);使用PSORT（https：//www.psort.org/）預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位;使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)蛋白功能域;使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn);使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)和進(jìn)化樹(shù);使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.5 熒光定量PCR

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)方法，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物qRgCDPK-F、qRgCDPK-R，以TiP41為內(nèi)參基因。參照熒光定量PCR試劑盒的步驟，配成20 μL的體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物各0.4 μL、QN Rox Reference Dye 0.1 μL、ddH2O 7.1 μL、模板cDNA 2 μL。 PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃ 20 s，變性95 ℃ 1 s，退火56 ℃ 20 s，延伸95 ℃ 1 s，40個(gè)循環(huán);60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的Ct 值，利用2-ΔΔCt，分別計(jì)算不同組織的表達(dá)量。

2?結(jié)果與分析

2.1 RgCDPK基因的克隆

提取后的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)三條清晰條帶，條帶無(wú)降解及雜帶，說(shuō)明RNA質(zhì)量較高，無(wú)降解，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，特異性條帶長(zhǎng)度約為1 800 bp。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體后挑選陽(yáng)性克隆雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后經(jīng)ORF Finder 預(yù)測(cè)，該序列含有一個(gè)大小為1 770 bp的完整的開(kāi)放閱讀框，編碼589個(gè)氨基酸。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件與轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，克隆所得序列與轉(zhuǎn)錄組所得序列完全一致。通過(guò)BLAST 程序檢索，該片段與紫花風(fēng)鈴木（Handroanthus impetiginosus，PIN08903.1）、猴面花（Erythranthe guttata，XP_012857661）、旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum，KZV40794.1）CDPK 蛋白序列的同源性分別為89%、86%、82%。

采用 InterProScan 在線預(yù)測(cè)工具對(duì)地黃RgCDPK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，RgCDPK具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是在126～386位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和4個(gè)EF-hand，鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（433～461，470～498，512～540，542～570）由此確定該序列為地黃CDPK基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，將其命名為RgCDPK，將其序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)為MT024235。

2.2 RgCDPK的生物信息學(xué)分析

2.2.1 RgCDPK蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性分析?RgCDPK基因的開(kāi)放閱讀框大小為1 770 bp，共編碼589個(gè)氨基酸殘基。RgCDPK蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為66.06 kD;理論等電點(diǎn)（PI）為5.91，原子組成C2908H4624N832O890S18，總原子數(shù)為9 272，帶負(fù)電的氨基酸有80個(gè)（Asp + Glu），帶正電的氨基酸有89個(gè)（Arg + Lys）。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)CsCDPK17 的脂肪指數(shù)為73.06，不穩(wěn)定系數(shù)為45，推測(cè)其為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。總平均親水系數(shù)為-0.584，屬于親水性蛋白。

2.2.2 RgCDPK蛋白質(zhì)特性分析?使用TMpred軟件，預(yù)測(cè)RgCDPK蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示，RgCDPK蛋白可能存在一個(gè)跨膜螺旋，位置為309～327，方向由外到內(nèi)。使用SignalP 4.1分析RgCDPK的信號(hào)肽，結(jié)果顯示無(wú)明顯信號(hào)肽。RgCDPK可能定位于葉綠體。通過(guò)在線軟件對(duì)地黃RgCDPK蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，RgCDPK蛋白整個(gè)多肽鏈有71個(gè)磷酸化位點(diǎn)（>0.5），其中絲氨酸42個(gè)，蘇氨酸23個(gè)，酪氨酸6個(gè)。

2.2.3 RgCDPK的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)?使用NPSA server在線軟件預(yù)測(cè)RgCDPK的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明RgCDPK蛋白由41.94%的α-螺旋、12.05%的延伸鏈、6.62%的β-轉(zhuǎn)角和39.39%的無(wú)規(guī)卷曲組成。使用Swiss-model在線軟件預(yù)測(cè)地黃RgCDPK的三級(jí)結(jié)構(gòu)。同源建模結(jié)果顯示（圖2）， RgCDPK與擬南芥CDPK（SMTL ID：3q5i.1）相似度為33.94%，具有較高可信度（>30%）。

通過(guò)在線軟件對(duì)地黃RgCDPK蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，RgCDPK蛋白整個(gè)多肽鏈有71個(gè)磷酸化位點(diǎn)（>0.5），其中，絲氨酸42個(gè)，蘇氨酸23個(gè)，酪氨酸6個(gè)。

2.2.4 RgCDPK的系統(tǒng)進(jìn)化及同源性分析?使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。擬南芥CDPK蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)亞族，其中AtCDPK1、AtCDPK2、AtCDPK26屬于Ⅰ家族;AtCDPK15、AtCDPK19、AtCDPK23、AtCDPK29、AtCDPK33、AtCDPK34屬于Ⅱ家族;AtCDPK13、AtCDPK14、AtCDPK24屬于Ⅲ家族;AtCDPK16、AtCDPK18、AtCDPK28屬于Ⅳ家族。如圖3所示，RgCDPK與AtCDPK28處于同一分支，說(shuō)明其可能屬于CDPK Ⅳ家族，與擬南芥AtCDPK28同源性最近。

運(yùn)用DNAMAN在線軟件，將芝麻SiCDPK8、紫花風(fēng)鈴木HiCDPK等與地黃RgCDPK進(jìn)行多序列比對(duì)。如圖4所示，RgCDPK具有4 個(gè)典型的CDPK結(jié)構(gòu)域：可變區(qū)、催化區(qū)、自抑制區(qū)和調(diào)控區(qū)?？勺儏^(qū)位于N端，同源性極低;蛋白激酶區(qū)保守性較高，由約300 個(gè)氨基酸構(gòu)成，因該區(qū)含有起催化作用的Ser/Thr 蛋白激酶序列，因此也可稱(chēng)為催化區(qū)，主要起與ATP 結(jié)合的作用;在C端有4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)，此為保守區(qū)，主要起促進(jìn)Ca2+結(jié)合的作用，末端保守性較差。

2.3 ?RgCDPK的組織表達(dá)分析

使用熒光定量PCR技術(shù)分析地黃塊根、葉、花瓣中的表達(dá)特性，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，RgCDPK在地黃塊根、葉和花瓣中均有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高，而在花瓣中的表達(dá)量最低。在根和葉中的表達(dá)量差異較小。

3?討論與結(jié)論

本研究克隆得到一條新的完整的RgCDPK基因，其開(kāi)放閱讀框大小為1 770 bp，共編碼589個(gè)氨基酸殘基。對(duì)RgCDPK基因的結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其保守結(jié)構(gòu)具有4 個(gè)典型的可變區(qū)、催化區(qū)、自抑制區(qū)和調(diào)控區(qū)，符合鈣依賴(lài)蛋白激酶典型結(jié)構(gòu)特征。CDPK在植株中分布廣泛，在根、葉、花、果實(shí)及種子等各器官中均能檢測(cè)到CDPK基因的表達(dá)（Raices et al.，2003;白曉璟等，2019;雷蕾等，2019;Li et al.，2019）。本研究通過(guò)熒光定量PCR對(duì)RgCDPK在地黃不同組織中的特異性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RgCDPK在葉中表達(dá)量最高，其次是根，在花瓣中的相對(duì)表達(dá)量最少。鐵皮石斛DoCDPK1也屬于CDPK Ⅳ家族，但其在葉片中表達(dá)量最高，其次是莖，在根中表達(dá)量最低（盛況等，2017）。說(shuō)明RgCDPK的表達(dá)具有組織特異性，且不同植物中的CDPK即使屬于同一亞家族，其表達(dá)模式也可能不同。

本研究克隆得到了1條新的CDPK基因，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，其可能屬于CDPKD家族，與擬南芥AtCDPK28同源性最近。AtCDPK28缺失引起擬南芥Nacl抗性降低，而其超表達(dá)則增加擬南芥對(duì)

滲透脅迫的耐受性。同屬于CDPKD家族的DoCDPK1在低溫、ABA與鹽脅迫均可被誘導(dǎo)，因此推測(cè)其可能在地黃滲透脅迫等逆境環(huán)境中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。連作障礙是指連續(xù)在同一土壤上栽培同種作物或近緣作物引起的植物生長(zhǎng)發(fā)育異常（王剛等，2019），連作過(guò)程中植物也受到一定程度的脅迫。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)系統(tǒng)在地黃連作障礙形成過(guò)程中扮演著重要的角色（郭冠瑛等，2013），而鈣依賴(lài)蛋白激酶 （CDPK）（張毓露等，2012）在地黃連作的生理響應(yīng)中可能也發(fā)揮著重要作用。CDPK11基因在連作地黃膨大前、中、后期的表達(dá)量均顯著高于頭茬地黃，而CDPK20在膨大中期連作地黃中表達(dá)量顯著高于頭茬地黃，其他時(shí)期均下調(diào)（楊楚韻等，2017）。這可能是不同CDPK蛋白通過(guò)相互補(bǔ)充和相互增益在地黃連作障礙的形成過(guò)程中承擔(dān)不同的角色，從而介導(dǎo)地黃連作障礙的形成。RgCDPK基因作為地黃CDPK基因家族中的一員，可能在地黃連作反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能，但本研究未對(duì)其在地黃連作不同時(shí)期、不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行研究，因此其如何參與地黃連作障礙中Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及具體的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等并不清楚，還需要進(jìn)行深入的研究。

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（責(zé)任編輯?何永艷）