探討多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)用于兒童常見細(xì)菌及真菌血流感染的價(jià)值※

張 帥,倪 敏,王 幀,楊俊梅

(1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院,河南 鄭州450000;2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院,河南 鄭州450000)

血流感染可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)高熱或寒戰(zhàn)等癥狀,主要由各種病原菌入侵血液并釋放毒素所致,屬于感染性疾病之一[1]。若血流感染患兒未能得到及時(shí)有效的治療,則可導(dǎo)致機(jī)體各器官功能發(fā)生損傷,并出現(xiàn)呼吸衰竭等不良情況,嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。隨著激素及有創(chuàng)診療技術(shù)在臨床的廣泛應(yīng)用,各種新型廣譜抗生素不斷更新,但兒童血流感染發(fā)病率及病死率仍未得到有效控制[2]。而兒童自身抵抗能力較低,故在細(xì)菌耐藥性較為嚴(yán)重的情況下,出現(xiàn)血流感染的概率較高。為此,臨床加強(qiáng)對(duì)致病微生物的檢測(cè),對(duì)制訂治療方案和治療措施、降低患兒死亡率等具有重要意義。血培養(yǎng)是臨床最常使用的診斷方式,但存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等不足[3-4]。為探究一種更為有效的診斷方式,本次研究主要探討多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)在兒童常見細(xì)菌及真菌血流感染的診斷效果。具體情況報(bào)道如下。

1 臨床資料

選擇2016年5月至2018年5月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的140例疑診血流感染患兒。其中男73例,女67例;年齡最小2個(gè)月,最大7歲,平均(4.32±3.20)歲;體溫＞38℃112例,體溫＜36℃28例。所選取對(duì)象均呈不同程度的高熱及寒戰(zhàn)癥狀;且其家屬均已簽署知情同意書。

2 檢測(cè)方法

2.1 檢測(cè)設(shè)備 檢測(cè)設(shè)備主要包括法國(guó)生物梅里埃VITK2 co mpact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、Bac TALERT 3D120全自動(dòng)培養(yǎng)儀、廣州健侖生物科技有限公司生產(chǎn)的QIAa mp Blood DNA Mini Kit及美國(guó)Gene Amp PCR Syate m 2720PCR反應(yīng)程序。儀器操作步驟均按照儀器說(shuō)明書等嚴(yán)格實(shí)施。

2.2 檢測(cè)方法 收集140例患兒外周靜脈血,并送至本院細(xì)菌室進(jìn)行微生物培養(yǎng)及藥敏測(cè)驗(yàn);在采集與培養(yǎng)過(guò)程中均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作及原則進(jìn)行。采用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定與確認(rèn)所選樣本;并采用全自動(dòng)培養(yǎng)儀培養(yǎng)標(biāo)本;采用QIAamp Blood DNA Mini Kit提取人類基因組DNA和對(duì)照菌株。特異性引物主要包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、尿腸球菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動(dòng)桿菌;聚合酶鏈反應(yīng)體系：2.5μL 10×Buffer、2.0μL Mg Cl2(25 mmol/L)、2.5μL d NTP(2.5 mmol/L)、0.5μL引物(10μmol/L)、8.85μL dd H2O、2μL DNA 模板、0.15μL Taq酶(5 U/μL)組成;采用美國(guó) Gene Amp PCR Syate m 2720PCR反應(yīng)程序檢測(cè)多重聚合酶鏈反應(yīng)。對(duì)照菌株及人類基因組DNA主要檢測(cè)多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)特異性、DNA提取及聚合酶鏈反應(yīng)。

3 療效觀察

3.1 觀察指標(biāo) 分析多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)在兒童常見細(xì)菌及真菌血流感染檢測(cè)中的特異性與敏感性。統(tǒng)計(jì)分析血培養(yǎng)法與多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次檢測(cè)結(jié)果均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算與分析,計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示,采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果

(1)多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)特異性與敏感性微生物經(jīng)多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌檢測(cè)下限值為103 CFU/mL。其他微生物如大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、肺炎克雷伯菌等均經(jīng)DNA擴(kuò)增后,呈單一條帶;其產(chǎn)物大小與檢測(cè)前預(yù)期結(jié)果符合度較高;其他微生物與人類基因組DNA無(wú)條帶生成。

(2)微生物檢查情況比較 在本次研究的140份標(biāo)本中,血培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本共有16份(11.43%);多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本共有30份(21.43%)。多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)陽(yáng)性率高于血培養(yǎng)法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝5.10,P＝0.02＜0.05)。見表1。

表1 血培養(yǎng)法與多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)微生物檢出比較

4 討論

血流感染屬于較為嚴(yán)重的感染性疾病之一,主要指各種病原菌及其他毒素入侵血流引起的臨床綜合征[5]。由于兒童機(jī)體抵抗力與免疫力相對(duì)較低,故血流感染發(fā)生率高于青年、中年或老年人群。本病發(fā)病過(guò)程中有炎癥介質(zhì)的激活與釋放,而持續(xù)性血流感染則可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)、呼吸急促、神志改變、皮疹、心動(dòng)過(guò)速等臨床癥狀;且隨著病情的發(fā)展,還可導(dǎo)致患兒各器官功能衰竭,甚至導(dǎo)致其休克與死亡[6]。故明確兒童血液中細(xì)菌及真菌的種類,對(duì)制訂臨床治療方案、為血流感染提供流行病學(xué)信息等具有積極意義。

血培養(yǎng)法是臨床較為常見的檢測(cè)手段,將采集的血液注入血培養(yǎng)瓶,放入專業(yè)的血培養(yǎng)設(shè)備后,使其在適宜的溫濕度下進(jìn)行孵育,繼而實(shí)施檢測(cè);若檢測(cè)到細(xì)菌生長(zhǎng)則會(huì)發(fā)出陽(yáng)性報(bào)告[7]。血培養(yǎng)法雖然能提供一定的檢測(cè)數(shù)據(jù),但由于血培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、陽(yáng)性率低,故常無(wú)法滿足臨床診斷與治療的實(shí)際需求。有研究顯示,16Sr DNA-PCR在檢測(cè)兒童血流感染中具有較高的敏感性,且陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較高。但由于16S r DNAPCR檢測(cè)過(guò)程極易受到污染,故檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率較高。在標(biāo)本污染的前提下,外來(lái)微生物DNA則會(huì)放大擴(kuò)增,繼而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外,由于16Sr DNA-PCR的檢測(cè)環(huán)境要求相對(duì)較高,故其應(yīng)用范圍存在一定的局限性[8-9]。因此,應(yīng)尋求一種方便、快速、準(zhǔn)確、陽(yáng)性率高的血流感染病原菌檢測(cè)方式。

多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)是一種分子生物學(xué)技術(shù),將其應(yīng)用于兒童常見細(xì)菌及真菌血流感染的檢測(cè),對(duì)指導(dǎo)感染性疾病的診療具有重要意義。多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)在檢測(cè)過(guò)程中可放大與擴(kuò)增病原菌核酸成分,分析與檢測(cè)病原菌遺傳學(xué)信息后,可得到較為準(zhǔn)確的診斷結(jié)果[10]。故在上述結(jié)果中,140例患兒經(jīng)血培養(yǎng)檢測(cè)后,其陽(yáng)性率僅為11.43%;而多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果為21.43%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見,在兒童血流感染檢測(cè)中,多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)敏感性高于血培養(yǎng)法。多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)主要將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌、尿腸球菌、肺炎克雷伯菌、鮑氏不動(dòng)桿菌作為兒童血流感染的特異性引物,故可有效保障多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)的敏感性與特異性[11]。本研究中,以上7種兒童常見的血流感染微生物經(jīng)多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)后,均顯示為單一且擴(kuò)增的條帶,其區(qū)分度相對(duì)良好;在人類基因組DNA及其他微生物中,并無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn);同時(shí)金黃色葡萄球菌下限為103 CFU/mL。故可進(jìn)一步說(shuō)明多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)在兒童血流感染的檢測(cè)中具有更高的敏感性與特異性。此外,多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)于檢測(cè)環(huán)境的要求相對(duì)較低,特異性引物不易被污染,故其檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確,可為臨床提供可靠的診治信息。需要注意的是,在采用多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)兒童血流感染過(guò)程中,需經(jīng)過(guò)仔細(xì)的復(fù)核,保障與提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。但多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)仍存在一定的缺陷,因兒童常見病原菌譜常受到地區(qū)、人群、季節(jié)、氣候等方面的影響[12],故在實(shí)施多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)前,應(yīng)對(duì)地區(qū)兒童血流感染等信息作相關(guān)調(diào)查,保障多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)的檢測(cè)質(zhì)量,診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性與有效性。

綜上所述,多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)相較于血培養(yǎng)法,具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)消耗時(shí)間短、高特異性、高敏感性、污染風(fēng)險(xiǎn)小、成本費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)。故在兒童常見細(xì)菌及真菌血流感染的臨床診斷中,可將多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)作為兒童血流感染的主要診斷方式,進(jìn)而準(zhǔn)確鑒定與分析兒童血流感染中常見的病原菌種類,為臨床治療兒童血流感染提供重要參考依據(jù),提高臨床療效。