含抗生素廢水脫氮處理中厭氧氨氧化工藝的應(yīng)用及作用機(jī)制研究進(jìn)展

張 茜，程雅菲,2，黃寶成,2，金仁村,2

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州師范大學(xué)生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與恢復(fù)杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，anammox)工藝具有無須外加有機(jī)碳源、脫氮負(fù)荷高和運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是目前最為經(jīng)濟(jì)的生物脫氮工藝之一.但厭氧氨氧化菌(AnAOB)細(xì)胞產(chǎn)率低、生長緩慢(倍增時(shí)間長達(dá)11 d)、對(duì)外界環(huán)境條件敏感[1]，這極大地限制了其在實(shí)際工程中的大規(guī)模應(yīng)用.近年來，我國制藥和畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，產(chǎn)生的廢水中含有殘留抗生素，極有可能會(huì)抑制anammox菌的活性，從而對(duì)anammox工藝帶來負(fù)面影響.為此，本文通過分析抗生素的來源及污染現(xiàn)狀，綜述anammox處理含抗生素廢水的脫氮效果，剖析抗生素對(duì)厭氧氨氧化菌的作用機(jī)制，以期為anammox工藝在抗生素廢水處理中的工程應(yīng)用提供依據(jù).

1 抗生素的來源及污染現(xiàn)狀

自青霉素被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床后，人類便開始大范圍地應(yīng)用抗生素.當(dāng)前，由于抗生素的廣譜抗菌效果，人類廣泛使用該藥物來治療人和動(dòng)物的感染性疾病.不僅如此，一些抗生素還被添加到飼料添加劑中來提高畜禽的免疫力，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育[2-3].目前，抗生素可由天然、半合成及人工合成等途徑生產(chǎn)得到.雖然抗生素在畜牧產(chǎn)業(yè)的廣泛應(yīng)用為人類疾病控制以及畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)，但它也帶來了一系列環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).攝入人體或動(dòng)物體內(nèi)的抗生素類藥物大多不能被充分吸收利用，通常會(huì)隨排泄物進(jìn)入污水處理廠或直接進(jìn)入環(huán)境.雖然許多抗生素的半衰期較短，但由于頻繁使用甚至濫用，導(dǎo)致其極易進(jìn)入環(huán)境，形成“假持久性”現(xiàn)象[4-5]，最終成為環(huán)境中的一類新型污染物.我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，據(jù)報(bào)道，我國各級(jí)醫(yī)院住院患者抗生素使用率超過70%，遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織 (WHO) 所推薦的使用率(30%)，同時(shí)也高于歐美發(fā)達(dá)國家(10%)和其他發(fā)展中國家(42%)[6].由此看出，我國濫用抗生素的情況不容樂觀.據(jù)估算，2003 年我國生產(chǎn)的青霉素高達(dá) 2.8 萬噸，占世界總量的 60%；土霉素總生產(chǎn)量為 1 萬噸，占世界總量的 65%[7].此外，抗生素在畜牧業(yè)中的使用也十分普遍，我國每年大約有5 000～7 000 噸土霉素和750～1 000 噸金霉素被用于動(dòng)物養(yǎng)殖；農(nóng)業(yè)中使用的抗生素種類已經(jīng)包括了全部醫(yī)用抗生素種類[6]，表明我國抗生素在農(nóng)業(yè)中的使用也十分廣泛.

含抗生素的廢水一旦被排放至環(huán)境中，極有可能會(huì)誘導(dǎo)受納水體中抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的產(chǎn)生.高濃度抗生素會(huì)對(duì)環(huán)境中的微生物產(chǎn)生抗生素選擇壓力，使某些微生物或病菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，進(jìn)而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的改變，甚至對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不良后果[8].此外，即使抗生素從一個(gè)區(qū)域移除，該環(huán)境中的ARGs和ARB也可能不會(huì)在短期內(nèi)消失.不僅如此，有報(bào)道稱，即使ARB被滅活，它攜帶的抗生素抗性基因在被釋放到環(huán)境中后仍可長期保持活性，直到找到下一個(gè)受體細(xì)菌.

2 厭氧氨氧化工藝處理含抗生素廢水脫氮效果

2.1 制藥廢水

在藥品的研究和生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量抗生素廢水，這些制藥廢水的處理一直以來都是水污染防治的重點(diǎn)和難點(diǎn).根據(jù)生產(chǎn)的藥品種類和生產(chǎn)工藝的不同，制藥廢水主要可分為：抗生素、合成醫(yī)藥、中成藥生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢水及各類醫(yī)藥制劑生產(chǎn)過程中的洗滌水[9].例如，抗生素廢水主要由包括營養(yǎng)液、發(fā)酵殘基、溶劑萃取過程中的萃取殘液、溶劑回收后分散的蒸餾殘液、離子交換過程中排放的吸附廢液、水中細(xì)菌輸液和發(fā)酵濾液中的不溶性抗生素等構(gòu)成[10].一般來說，制藥廢水具有廢水量大、水質(zhì)復(fù)雜、毒性強(qiáng)、有機(jī)物和懸浮物濃度高、含鹽量高、色度深、可生化性差等主要特點(diǎn)[11-12]，屬于難處理的高濃度工業(yè)廢水.

何永淼[13]采用兩級(jí)厭氧-好氧-厭氧氨氧化組合工藝處理內(nèi)蒙古某金霉素制藥企業(yè)生產(chǎn)廢水和某淀粉廠出水的混合廢水.結(jié)果表明，該組合工藝對(duì)COD的總?cè)コ式橛?4%～98%，對(duì)氨氮的去除效率高于90%，對(duì)總氮的去除效率介于80%～95%，取得了良好的處理效果.王鈺楷[14]對(duì)一體式anammox工藝處理經(jīng)厭氧和好氧預(yù)處理后的金霉素廢水的效果進(jìn)行了研究.試驗(yàn)結(jié)果表明，一體式anammox工藝處理二級(jí)厭氧稀釋出水時(shí)，廢水中氨氮和總氮的去除率均可達(dá)80%，總氮容積負(fù)荷最高可達(dá)1.0 kgN/(m3·d).在處理好氧出水試驗(yàn)中，氨氮去除率高于90%，總氮去除最高可達(dá)80%，總氮容積負(fù)荷為0.6 kgN/(m3·d).結(jié)果表明，采用anammox處理高氨氮抗生素廢水從技術(shù)上和經(jīng)濟(jì)上均可行.傅海霞[15]對(duì)亞硝化-厭氧氨氧化工藝處理納他霉素廢水厭氧出水進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，在長污泥齡、低溶解氧的條件下，總氮平均去除率為78%，最高時(shí)可達(dá)92.5%，試驗(yàn)最終出水氨氮濃度為8.38 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度為9.37 mg/L，總氮濃度為38.12 mg/L，取得了良好的處理效果.

2.2 畜禽養(yǎng)殖廢水

抗生素的濫用致使畜禽養(yǎng)殖廢水中富含大量的抗生素及其代謝產(chǎn)物.由于缺乏有力的監(jiān)管措施和科學(xué)的養(yǎng)殖知識(shí)，同時(shí)受到經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，畜禽養(yǎng)殖場普遍存在超劑量使用違規(guī)藥品的現(xiàn)象[16].大多數(shù)的抗生素、激素難以被動(dòng)物腸胃吸收，約30%～90%以代謝產(chǎn)物和原始狀態(tài)排出[17].劉新程等發(fā)現(xiàn)江蘇省的集約化養(yǎng)殖場的畜禽排泄物中，土霉素(OTC)的檢出率和殘留量分別為17.3%、1.95 mg/kg，金霉素(CTC)的檢出率和殘留量分別為30.9%、 9.75 mg/kg.據(jù)報(bào)道，肥料中土霉素的濃度為0.003～250 mg/L[18-19].如此高濃度的土霉素和氨同時(shí)出現(xiàn)在豬場廢水消化液中，給廢水生物脫氮工藝帶來巨大的挑戰(zhàn).

Zhang等[20]用模擬畜禽養(yǎng)殖廢水研究了諾氟沙星(NOR)對(duì)anammox工藝的影響.結(jié)果表明，0.001 mg/L諾氟沙星投入后立即對(duì)微生物產(chǎn)生來了抑制， anammox的總氮去除負(fù)荷(NRR)降低了27.5%，比厭氧氨氧化活性(SAA)降低了30%；但停止諾氟沙星(NOR)投加并運(yùn)行一個(gè)月后，反應(yīng)器性能恢復(fù)到初始水平.磺胺類抗生素是另一種被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧行業(yè)的抗生素.Du等[21]研究了不同濃度磺胺類抗生素對(duì)anammox的影響.結(jié)果表明，在低濃度磺胺甲嘧啶(SM)和磺胺地托辛(SDM)條件下(低于3 mg/L)，anammox菌未受影響，主要是由于anammox菌表面分泌較多的EPS可保護(hù)其免受抗生素的侵害；在5～ 7 mg/L濃度下，SDM對(duì)anammox菌產(chǎn)生了明顯的抑制作用，Candidatus Brocadia的豐度由2.57%下降到0.39%.當(dāng)SDM和SM濃度升高至5～9 mg/L時(shí)，anammox進(jìn)一步受到了抑制，氨氮積累嚴(yán)重.

3 抗生素對(duì)厭氧氨氧化菌的作用機(jī)制

3.1 胞外聚合物(EPS)的變化

Anammox顆粒由菌體和胞外多聚物(extracellular polymeric substance，EPS)組成.tif 的主要成分是蛋白質(zhì)和多糖，還有少量脂質(zhì)、核酸以及腐殖酸類物質(zhì)[22]，由顆粒中上菌體合成并分泌產(chǎn)生，不僅可用作黏結(jié)劑促使細(xì)胞團(tuán)聚，使污泥顆?；?，通常還是微生物細(xì)胞的第一道屏障，直接與水環(huán)境中的物質(zhì)接觸和相互作用，在外源毒性物質(zhì)刺激下，微生物將分泌更多的EPS，以保護(hù)自身，減輕其毒害作用.tif 在anammox顆粒污泥的形成、維持和工作中發(fā)揮著重要作用，與其兩大成分密切相關(guān).Liu和Hou等[23-24]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)含量與細(xì)菌細(xì)胞表面的疏水性呈正相關(guān)；然而，另一些研究[25]表明，多糖對(duì)anammox的顆粒化起著更重要的作用.此外，Zhang等[26]對(duì)3種廣譜抗生素阿莫西林、氟洛芬和磺胺二甲嘧啶的抗性研究表明，在長期實(shí)驗(yàn)過程中，前3 d內(nèi)污泥活性降低了一半，但隨后，anammox菌逐漸恢復(fù)，污泥活性和血紅素水平提升，EPS水平提升，高于初始水平.

另一方面，厭氧氨氧化菌的胞外聚合物防御機(jī)制有助于增加其耐受性.Zhang等[27]研究表明，細(xì)胞外產(chǎn)物的變化是厭氧氨氧化菌在抗生素脅迫下所發(fā)生的明顯反應(yīng).胞外聚合物(EP, extracellular products, consisting of SMP and EPS)基質(zhì)中含有豐富的官能團(tuán)，如羧基、磷基、胺基和羥基，它們在中性pH下帶負(fù)電荷，能夠通過靜電吸引或其他相互作用與多價(jià)陽離子形成有機(jī)金屬配合物[28].細(xì)胞EPS含量的升高有助于增強(qiáng)其與相鄰厭氧氨氧化菌細(xì)胞的作用力，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從而防止重金屬進(jìn)入細(xì)胞.OTC有電子供體基團(tuán)，能與金屬離子形成絡(luò)合物(如Cu-OTC絡(luò)合物)[29]，該絡(luò)合物可進(jìn)一步通過靜電力吸附在anammox顆粒表面，形成EP -Cu-OTC絡(luò)合物.Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)，EPS產(chǎn)量的變化與厭氧氨氧化菌的特異生長率呈正相關(guān).這些行為可以認(rèn)為是厭氧氨氧化菌減少抗生素?cái)z入的防御策略.

3.2 干擾蛋白質(zhì)合成

不同種類抗生素對(duì)微生物的抑制機(jī)理不同，可干擾細(xì)胞壁合成的抗生素有青霉素、先鋒霉素、萬古霉素和環(huán)絲氨酸等；干擾核糖體蛋白質(zhì)合成的抗生素有土霉素、慶大霉素、鏈霉素和氯霉素等；破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的抗生素有多黏菌素等[30-31].

研究表明，青霉素G對(duì)厭氧氨氧化菌活性的短期抑制作用較小，但在長期作用下會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生顯著的抑制[32].青霉素是β-內(nèi)酰胺類抗生素，主要通過抑制轉(zhuǎn)肽酶和細(xì)胞壁上肽聚糖的合成，抑制革蘭氏陽性菌[33].由于厭氧氨氧化菌細(xì)胞壁不含肽聚糖，短期實(shí)驗(yàn)中青霉素G幾乎不會(huì)對(duì)厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生影響[34].但厭氧氨氧化菌的基因組中存在編碼肽聚糖合成以及肽聚糖結(jié)合蛋白的基因[35]，所以在長期運(yùn)行的過程中，青霉素G可能通過抑制肽聚糖的合成而抑制厭氧氨氧化菌的活性.

土霉素對(duì)厭氧氨氧化活性的短期與長期抑制特性和青霉素類似[36-37].土霉素屬于四環(huán)類抗生素，四環(huán)類抗生素可與核糖體30S亞基的α位特異性結(jié)合，使氨?；?tRNA無法進(jìn)入α位，抑制核聚糖體形成，從而抑制細(xì)菌的生長[37].對(duì)于厭氧氨氧化菌而言，顆粒污泥對(duì)底物的傳質(zhì)具有阻礙作用，從而有助于緩解土霉素的抑制作用[38].Tang等[39]研究表明，厭氧氨氧化顆粒污泥表面含有大量胞外聚合物，這些胞外聚合物電負(fù)性強(qiáng)，可以吸附溶液中的有毒物質(zhì)，在一定程度上阻礙其與細(xì)胞的直接接觸.此外，Tan等[40]研究表明,微生物在高度聚集的條件下其基因表達(dá)能力更強(qiáng)，因此，微生物對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力也會(huì)更強(qiáng).厭氧氨氧化菌在顆粒污泥中的聚集密度較高，可能會(huì)使土霉素對(duì)厭氧氨氧化菌的抑制作用降低.

多黏菌素是從多黏桿菌培養(yǎng)液中獲得的多肽類抗生素，對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性菌有殺滅作用.多黏菌素含有帶正電荷的游離氨基，革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上有帶負(fù)電荷的磷酸根，帶正電荷的游離氨基和帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜面積增大，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的磷酸鹽、核苷酸、氨基酸等成分外漏，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡.Ding等[41]研究了硫酸多黏菌素B對(duì)污泥厭氧氨氧化活性的影響，結(jié)果表明,污泥厭氧氨氧化活性的半抑制濃度(IC50)為10.2 mg/L.馬靜等[42]研究表明，青霉素G鈉、土霉素鹽酸鹽和硫酸多黏菌素E對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥活性的抑制作用依次增強(qiáng).在批次實(shí)驗(yàn)中，雖然3種抗生素抑制特性不同，但是厭氧氨氧化顆粒污泥對(duì)它們都具有較好的耐受能力.

3.3 耐抗生素基因

由于抗生素殘留的選擇性壓力[43]，抗生素耐藥細(xì)菌不斷發(fā)展.如果抗生素耐藥基因(ARGs)被轉(zhuǎn)移到危險(xiǎn)的病原體上，抗生素的效力可能會(huì)降低.即使在沒有選擇壓力的情況下，ARGs也可以存在于自然環(huán)境中[44-46].在國際上，ARGs和殘留的抗生素已經(jīng)被認(rèn)為是新興的環(huán)境污染物[47-48].

微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要有：1)抗生素通過降解或取代活性基團(tuán)而失活；2)抗生素不能與抗生素靶點(diǎn)的修飾聯(lián)合使用，以顯示耐藥性；3)抗生素通過特異性或通用的抗生素外排泵排出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度，表現(xiàn)出耐藥性；4)其他耐藥機(jī)制包括在細(xì)胞膜上形成多糖，減少抗生素進(jìn)入細(xì)胞[49].

外排泵基因的耐藥機(jī)制及其對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)已被廣泛報(bào)道.然而，這只是微生物的一種自我保護(hù)機(jī)制，并不能降低抗生素的含量.酶修飾基因是OTC降解的主要機(jī)制之一，它可以通過合成的氧化還原酶對(duì)四環(huán)素進(jìn)行化學(xué)修飾使其失活.Shi等[50]研究表明，通過比較外排泵基因(teta、tetB、tetC)和酶修飾基因(tetX)變異的豐度，可以推測anammox微生物主要通過泵外排來抵抗OTC的生物毒性.tetX含量越高，說明anammox混合培養(yǎng)具有降解OTC的潛力.

Tao等[51]研究表明，污水處理廠可部分減少耐藥菌的擴(kuò)散，沉降等附加處理對(duì)ARGs的去除效果影響不大.在大多數(shù)農(nóng)場，經(jīng)過好氧處理后，ARGs的絕對(duì)數(shù)量會(huì)下降.較早的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，通過活性污泥和生物過濾處理，水中tet基因的去除率可達(dá)97%以上[52].Engemann的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，tet基因的去除率與光照射顯著有關(guān)[53].因此，在好氧池中，氧氣和光照可以減少抗性細(xì)菌的數(shù)量.此外，延長好氧裝置的處理時(shí)間有助于減少抗生素抗性細(xì)菌向環(huán)境的釋放.鑒于污水處理流程以及抗性基因種類上存在的差異，通過該方式實(shí)現(xiàn)的抗生素抗性細(xì)菌的去除率為18.15%～99.99%.

4 總結(jié)和展望

近年來，人類大量使用含抗生素藥物來治療人和動(dòng)物的感染性疾病，并且也將該藥物添加到飼料中從而提高畜禽免疫力，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育.但是，攝入人體或動(dòng)物體內(nèi)的抗生素類藥物大多不能被充分吸收利用，通常會(huì)隨排泄物進(jìn)入污水處理廠或直接進(jìn)入環(huán)境，成為環(huán)境中的一類新型污染物.另外，含抗生素的廢水一旦被排放至環(huán)境中，極有可能會(huì)誘導(dǎo)受納水體中抗性細(xì)菌和抗性基因的產(chǎn)生.高濃度抗生素會(huì)對(duì)環(huán)境中的微生物產(chǎn)生抗生素選擇壓力，使某些微生物或病菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，進(jìn)而導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)的改變，甚至對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不良后果.目前，anammox工藝無法直接用于處理抗生素廢水，主要應(yīng)用兩級(jí)厭氧-好氧-厭氧氨氧化、一體式anammox工藝、亞硝化-厭氧氨氧化等工藝處理.抗生素廢水可能會(huì)通過干擾蛋白質(zhì)合成等過程對(duì)anammox處理過程產(chǎn)生抑制.與此同時(shí)，anammox細(xì)菌可能通過胞外EPS的分泌以及抗性基因的產(chǎn)生對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性.

但是，在抗生素脅迫下厭氧氨氧化菌的代謝響應(yīng)機(jī)制仍然不明，抗生素抑制anammox微生物的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.因此，對(duì)于anammox而言，要盡可能降低抗生素對(duì)其的毒性，為此，要發(fā)展高效經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理技術(shù)，其中高級(jí)氧化技術(shù)有一定可行性，但如何優(yōu)化工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)高級(jí)氧化與anmmox的有效耦合仍然需要進(jìn)一步研究.近年來，發(fā)展迅速的微生物測序和組學(xué)分析手段可作為機(jī)制解析的有力工具.此外，Pruden等[47]通過廣泛研究表明，抗生素抗性基因已經(jīng)成為一種新的環(huán)境污染物，并提出環(huán)境工作者應(yīng)該重視抗生素抗性基因引起的生態(tài)問題，通過對(duì)抗性基因 (ARGs) 深入研究，逐漸認(rèn)識(shí)了抗生素抗性基因?qū)ξ⑸锘蚝蛯?duì)人類生活環(huán)境的危害.針對(duì)如何降低抗性基因的產(chǎn)生，已經(jīng)有了一些調(diào)控策略.例如通過在好氧池中增加溶解氧濃度以及光照將有助于減少抗生素不敏感細(xì)菌向水環(huán)境的釋放.未來，環(huán)境工作者仍然需要將高級(jí)氧化技術(shù)和聯(lián)合消毒技術(shù)等應(yīng)用到實(shí)際操作中，從而提高抗性基因的去除效率，實(shí)現(xiàn)抗性基因的有效控制.

厭氧氨氧化在廢水處理系統(tǒng)和自然生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮了巨大作用，對(duì)于全球氮循環(huán)具有重要影響，目前已有研究分析了厭氧氨氧化對(duì)局部生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率，深入對(duì)anammox細(xì)菌抗生素抗性基因的研究具有十分重要的意義.