高效液相色譜法測定乳粉中VK2（七烯甲萘醌）含量

王瑤，張敏，馬曉沖，劉星，柴艷兵*，張耀廣，李飛，李興佳

（君樂寶乳業(yè)集團(tuán)質(zhì)量管理中心，河北石家莊050021）

維生素K2，亦稱甲萘醌，是自然界中VK的主要存在形式之一[1-2]。VK2通過激活r-谷氨酸羧化酶促進(jìn)VK依賴性蛋白前體谷氨酸殘基（Glu）羧化為r-羧基谷氨酸（Gla），使蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性功能，對改善骨密度、促進(jìn)骨細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、防止血管硬化和止血等有重要作用[3-6]，是人體不可缺少的重要維生素之一。研究表明，母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有有限的VK來源，因?yàn)槟阁w通過胎盤傳輸給嬰兒的VK較少且在人乳中以非常低的含量（（5.170±1.521） μg/L）存在[7]，孕婦及嬰幼兒已經(jīng)成為VK嚴(yán)重缺乏人群[8]。VK2是唯一具有生物活性的VK，VK1、VK3只有在肝臟中轉(zhuǎn)化為VK2后才能和胃腸微生物產(chǎn)生的VK2一起被人體吸收利用[9]。因此，VK2得到越來越多國內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前，在乳粉中廣泛添加VK1，補(bǔ)充人體VK攝入的不足。但隨著對VK2研究的深入，一些企業(yè)推出添加VK2的乳粉產(chǎn)品，得到國家高度重視。目前我國尚未有乳粉中VK2的國家檢測標(biāo)準(zhǔn)，因此需建立VK2的測定方法，以保障乳粉產(chǎn)品質(zhì)量。

目前，VK2的檢測方法主要有液相色譜法[10-13]、毛細(xì)管電泳法[14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。七烯甲萘醌（menaquinone-7，MK-7）是VK2的一個(gè)類型，即VK2側(cè)鏈上含有7 個(gè)異戊二烯單元，是一種脂溶性維生素[17]。所有VK的結(jié)構(gòu)相似，但側(cè)鏈長度不同。側(cè)鏈越長，人體吸收性越好、生物活性越高[18]。因此，長鏈的甲萘醌（特別是MK-7）是最優(yōu)質(zhì)的，因?yàn)樗鼈兡軒缀跬耆蝗梭w吸收。本研究建立一種采用高效液相色譜法測定乳粉中MK-7含量的方法，為乳粉質(zhì)量管控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含VK2乳粉君樂寶乳業(yè)有限公司。

MK-7標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%）日本富士和光純藥公司；甲醇（色譜級）德國默克公司；異丙醇、正己烷（均為色譜級）中國迪馬科技有限公司；無水乙醇（色譜級）天津福晨化學(xué)試劑有限公司；碳酸鉀（分析純）天津永大化學(xué)試劑廠；脂肪酶（酶活力≥700 U/mg）美國Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.0 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配備熒光檢測器）美國安捷倫公司；Milli-Q ZMQS50001超純水機(jī) 美國密理博公司；LYNX4000高速落地離心機(jī)賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME203E/02電子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；RE311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀重慶雅馬拓有限公司；DKZ-ZB恒溫水浴振蕩器上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

MK-7標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）：稱取MK-7 10 mg（精確至0.1 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，用2 mL異丙醇溶解并用甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃避光保存，使用期限6 個(gè)月。

MK-7標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10.0 μg/mL）：準(zhǔn)確吸取100 μL 1 mg/mL的MK-7標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃避光保存，使用期限3 個(gè)月。

MK-7標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取0、20、50、80、100、150 μL 10.0 μg/mL MK-7標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）溶液定容至1 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取混合均勻的固體試樣2 g（精確到0.01 g）于離心管中，用10 mL溫水溶解；向上述試樣溶液中加入一定量脂肪酶，于（37±5） ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩，使其充分酶解；取出酶解好的試樣，依次加入5 mL無水乙醇和一定量碳酸鉀，充分混勻；加入20 mL提取溶劑，充分振搖后5 000 r/min離心5 min，取出上層清液，置于另一離心管中，再加入10 mL提取溶劑重復(fù)操作1 次，合并上清液；在離心管中加入5 mL超純水清洗上清液，取出上層清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于（40±2） ℃條件下蒸發(fā)至干；準(zhǔn)確加入1 mL甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）溶液復(fù)溶，充分振蕩溶解殘留物，過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測。

對脂肪酶添加量、酶解時(shí)間、碳酸鉀添加量及提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2.1 脂肪酶添加量與酶解時(shí)間優(yōu)化

乳粉中脂質(zhì)豐富，MK-7是脂溶性維生素，因此前處理時(shí)加入脂肪酶降解試樣中的脂肪和不飽和脂肪酸是必要的。脂肪酶添加量及振蕩酶解時(shí)間均會影響MK-7的提取，以MK-7加標(biāo)回收率為指標(biāo)對脂肪酶添加量（0、250、500、750 mg/g）與酶解時(shí)間（1、2、4、6、12 h）進(jìn)行優(yōu)化。MK-7加標(biāo)回收率按式（1）計(jì)算。

式中：C1為試樣中MK-7含量/（μg/100 g）；C2為MK-7添加量/（μg/100 g）。

1.3.2.2 碳酸鉀添加量優(yōu)化

皂化反應(yīng)指堿和酯反應(yīng)生成醇和羧酸鹽的反應(yīng)。乳粉經(jīng)過皂化反應(yīng)，酶解后的脂肪生成脂肪酸鹽溶解于水相中，與VK2分離[19]，但VK2對堿敏感[20]，堿的添加量會影響VK2的回收率。以MK-7加標(biāo)回收率為指標(biāo)對碳酸鉀添加量進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2.3 提取溶劑優(yōu)化

VK2在丙酮、正己烷和甲醇中均可溶解。以MK-7加標(biāo)回收率為指標(biāo)對3 種提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或具有同等性能的色譜柱；還原柱（4.0 mm×15 mm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；運(yùn)行時(shí)間30 min；檢測波長：激發(fā)波長243 nm，發(fā)射波長430 nm；流動(dòng)相：甲醇-異丙醇（4∶1，V/V）。

1.3.4 MK-7含量計(jì)算

試樣中MK-7的含量按式（2）計(jì)算。

式中：C為試樣中MK-7的含量/（μg/100 g）；ρ為試樣溶液中MK-7的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為復(fù)溶殘余物的定容體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；100為換算系數(shù)。

1.3.5 靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度考察

向空白樣品中添加適量MK-7標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)上述方法測定，測定色譜峰信噪比（RS/N），RS/N＞3對應(yīng)的MK-7含量為方法檢出限，RS/N＞10對應(yīng)的MK-7含量為方法定量限。

選擇不含MK-7的樣品，分別添加5、10、25 μg/100 g的MK-7，每個(gè)添加量6 個(gè)平行試樣，按優(yōu)化后的方法提取和測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，考察方法準(zhǔn)確度；計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 酶解條件選擇

圖1 脂肪酶添加量對MK-7加標(biāo)回收率的影響Fig. 1Effect of lipase addition on recovery of MK-7

由圖1可知，樣品前處理不添加脂肪酶時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率僅為1.26%；而脂肪酶添加量為250 mg/g時(shí)，加標(biāo)回收率可達(dá)87.66%，因此前處理時(shí)加入脂肪酶是必要的。脂肪酶添加量為250、500、750 mg/g時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率分別為87.66%、81.05%、86.61%，相差不大。綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益后確定脂肪酶添加量為250 mg/g。

由圖2可知：酶解1 h時(shí)MK-7加標(biāo)回收率為45.01%，酶解12 h時(shí)MK-7加標(biāo)回收率為74.93%，均明顯低于其他酶解時(shí)間；酶解時(shí)間為2、4、6 h時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率分別為87.66%、81.70%、88.40%，相差不大，而酶解12 h會大大降低檢測效率，因此，綜合考慮選擇酶解時(shí)間為2 h。

圖2 酶解時(shí)間對MK-7加標(biāo)回收率的影響Fig. 2Effect of hydrolysis time on recovery of MK-7

2.1.2 皂化條件選擇

圖3 碳酸鉀添加量對MK-7加標(biāo)回收率的影響Fig. 3 Effect of potassium carbonate on recovery of MK-7

由圖3可知：碳酸鉀添加量為250 mg/g時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率偏低，為78.10%，可能是由于皂化不完全；碳酸鉀添加量為500 mg/g時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率最高，為87.66%；再增加碳酸鉀添加量時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率開始逐漸降低。因此選擇碳酸鉀添加量為500 mg/g。

2.1.3 提取溶劑選擇

圖4 提取溶劑對MK-7加標(biāo)回收率的影響Fig. 4 Effect of extraction solvents on recovery of MK-7

由圖4可知：甲醇作為提取溶劑時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率僅為0.31%，不適合提取乳粉中的MK-7；丙酮作為提取溶劑時(shí)，MK-7加標(biāo)回收率為79.91%，略低于正己烷作為提取溶劑時(shí)的加標(biāo)回收率（87.76%），因此選擇正己烷作為提取溶劑。

2.2 分離度測定結(jié)果

VK的不飽和酮結(jié)構(gòu)共軛體系較小，不能產(chǎn)生熒光，但能通過衍生使VK同系物母核萘醌環(huán)產(chǎn)生熒光[21]。VK在分離色譜柱之后經(jīng)過還原色譜柱被還原，對還原型VK使用熒光檢測器進(jìn)行檢測。

圖5 MK-7標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.5 μg/mL）及樣品高效液相色譜圖Fig. 5 Chromatograms of MK-7 standard solution (1.5 μg/mL) and samples

由圖5可知，MK-7峰與相鄰峰有較好的分離度，容易辨識。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對質(zhì)量濃度分別為0.0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μg/mL的MK-7標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)檢測，以目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，以MK-7標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明，在MK-7標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度0.0～1.5 μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=229.430x-0.894（R2=0.999 95），線性關(guān)系良好。

2.4 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

當(dāng)稱樣量為2.0 g、定容體積為1 mL時(shí)，MK-7的檢出限為0.15 μg/100 g，定量限為0.5 μg/100 g。

表1 乳粉樣品中MK-7的加標(biāo)回收率（n=6）Table 1Recoveries and precision of MK-7 from spiked milk powder samples ( n= 6)

由表1可知，空白乳粉中添加5、10、25 μg/100 g MK-7時(shí)的平均回收率為87.9%～94.3%，表明方法準(zhǔn)確度良好。RSD為0.9%～6.4%，表明方法精密度較高。

3 結(jié)論

對乳粉中MK-7提取的酶解條件、皂化條件和提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，選取最優(yōu)提取方法，采用高效液相色譜外標(biāo)法定量測定乳粉中MK-7含量，方法前處理過程簡單、靈敏度高、檢測效率高、簡單快捷，可滿足乳粉中VK2含量的檢測要求。