免疫印跡法檢測(cè)TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)在梅毒診斷中的應(yīng)用評(píng)估

王欣俞，崔 凱，趙晉文，丁曉娜，王鑫琪，魏殿軍，張延海，高德祿，劉 朋，郭奕陽(yáng)

（1. 河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北廊坊 066251；2. 河北燕達(dá)醫(yī)學(xué)研究院，河北廊坊 066251；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000）

梅毒是由梅毒螺旋體（treponemia pallidum，TP）感染引起的，累及全身多器官的一種疾病，其傳播途徑主要是性傳播[1]。近年來(lái)梅毒的陽(yáng)性檢出率隨著人口流動(dòng)性增加及社會(huì)生活方式的改變而呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)[2]，特別是因?yàn)樵缙诿范镜牟∽兘M織，又增加了獲得性傳播人類免疫缺陷病毒（HIV）感染的風(fēng)險(xiǎn)[3]。其診斷主要根據(jù)病史，臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)梅毒特異性抗體是目前國(guó)內(nèi)外診斷梅毒的主要方法[4]，在梅毒診斷方面起到重要作用[5]。血清學(xué)檢測(cè)主要分為兩類：第1類為非TP抗原血清試驗(yàn)，常用方法包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）、性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）、甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）等；第2類為TP抗原血清試驗(yàn)，主要有梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA）、梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）、熒光密螺旋體抗體吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法及免疫印跡法等（WB）[6]。在梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法中，不同檢測(cè)方法學(xué)反應(yīng)性結(jié)果存在不一致性。梅毒螺旋體抗體免疫印跡試驗(yàn)（treponema pallidum-western blot，TP- WB）采用大量高度純化的梅毒螺旋體抗原，是目前較為公認(rèn)的梅毒特異性抗體確證方法[7]。本研究將梅毒血清學(xué)檢測(cè)初篩有反應(yīng)性的臨床患者入組，擬評(píng)估免疫印跡法檢測(cè)TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)在梅毒診斷中的應(yīng)用，研究結(jié)果為提高梅毒血清學(xué)診斷準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性納入河北燕達(dá)醫(yī)院2018年6月～2019年6月28 417例使用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（CMIA）篩查的梅毒血清樣本，選取檢測(cè)結(jié)果cutoff值S/CO比值＞15以及S/CO比值1～9患者樣本178例為研究對(duì)象，其中男性86例，女性92例，平均年齡56.22±19.15歲。分組：A組34例標(biāo)本，CMIA檢測(cè)有反應(yīng)性，TPPA陽(yáng)性且RPR檢測(cè)陽(yáng)性并伴有滴度；B組38例標(biāo)本，CMIA檢測(cè)有反應(yīng)性，cutoff值S/CO比值＞15，TPPA陽(yáng)性，RPR檢測(cè)陰性；C組106例標(biāo)本CMIA檢測(cè)有反應(yīng)性，cutoff值S/CO比值1～9，TPPA均陽(yáng)性，RPR檢測(cè)均陰性。梅毒感染診斷符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-梅毒診斷（WS273-2018）》[8]。

1.2 試劑和儀器 CMIA檢測(cè)法使用的廠家配套試劑盒及ARCHITECT i2000儀器，購(gòu)自美國(guó)雅培公司； TPPA檢測(cè)法使用原廠配套試劑，購(gòu)自日本富士公司的瑞必歐株式會(huì)社；TP- WB檢測(cè)法使用原廠配套試劑盒，購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司。

1.3 方法 抽取梅毒篩查對(duì)象空腹靜脈血5ml，3 000r/min離心10min，血清樣本加樣，2～8℃保存。CMIA法檢測(cè)梅毒特異性抗體，儀器測(cè)得樣本發(fā)光值并計(jì)算反應(yīng)物濃度，結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：S/CO≥1為梅毒螺旋體抗體反應(yīng)性，S/CO＜1為非反應(yīng)性。RPR法檢測(cè)非特異性抗體；TPPA法檢測(cè)梅毒特異性抗體；TP-WB法檢測(cè)梅毒特異性抗體，該方法將含有TPN47，TmpA， TPN45，TPN17和TPN15抗原的硝酸纖維素膜測(cè)試條與30μl血清樣品一起溫育，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的對(duì)人IgG特異的二抗孵育。在添加TMB后，免疫復(fù)合物在條帶上可視化為暗帶。通過(guò)與截止對(duì)照條帶的強(qiáng)度比較來(lái)評(píng)估每個(gè)抗原條帶的強(qiáng)度。檢測(cè)膜條置于全自動(dòng)免疫印跡儀EUROBlotMasterll上檢測(cè)，通過(guò)EUROLineScan軟件判讀結(jié)果，當(dāng)五個(gè)診斷帶中至少兩條特異性抗原帶明確顯色，測(cè)試被判讀為陽(yáng)性；一條特異性抗原帶明確顯色，測(cè)試被判讀為可疑。EUROLineScan軟件判讀結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為著色強(qiáng)度≥24判定為有反應(yīng)性，儀器判讀檢測(cè)線性為24～255。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用MetaboAnalyst 4.0 的Statistical Analysis 模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，具體步驟如下：樣本TPN47， TPN45，TPN17和TPN15及S/CO指標(biāo)值以列的方式分別錄入，以逗號(hào)間隔的CSV格式文件上傳，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)完整性檢查，樣本經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換及數(shù)據(jù)正態(tài)化后進(jìn)行相關(guān)分析及主成分聚類分析。其中，相關(guān)分析采用Pearson r 距離法；數(shù)據(jù)分類可視化采用主成分分析法（principal component analysis， PCA）。采用Medcalc軟件對(duì)CMIA 法S/CO做特征曲線(ROC曲線)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算曲線下面積，確定 CMIA 法對(duì)梅毒診斷效能最大時(shí)的 S/CO最佳截?cái)帱c(diǎn)。不同診斷方法計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP-WB法、CMIA法及TPPA法試驗(yàn)檢測(cè)梅毒抗體結(jié)果 178例受檢者中，TPPA法檢測(cè)結(jié)果梅毒陽(yáng)性共168 例，陽(yáng)性檢出率為94.4%；TP-WB法檢測(cè)結(jié)果梅毒陽(yáng)性 78例，陽(yáng)性率為43.8%，兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=104.2，P＜0.01），TP-WB法的靈敏度為 68.29%，特異度為90.91%。以TP-WB結(jié)果為參照，繪制ROC曲線，見(jiàn)圖1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，當(dāng) CMIA 法測(cè)得的 S/CO 截?cái)嘀禐?6.79時(shí)，敏感度為 79.41%，特異度為 96.05%，此時(shí)曲線下面積最大為 0.911，即6.79 為 CMIA 法的最佳診斷截?cái)嘀怠?/p>

圖1 S/CO 比值ROC曲線分析

圖2 TP-WB法四種抗體著色強(qiáng)度和S/CO比值相關(guān)性

2.2 TP-WB檢測(cè)TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)與CMIA法相關(guān)性分析 TP-WB法檢測(cè)TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)著色強(qiáng)度和CMIA法S/CO比值相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。同一樣本TPN15，TPN17，TPN45及TPN47抗體表達(dá)水平與S/CO比值均呈正相關(guān)（P ＜0.05），四種抗體表達(dá)水平與S/CO比值相關(guān)系數(shù)r分別為0.87，0.81，0.87及0.76。

2.3 TP-WB法著色強(qiáng)度分組的結(jié)果分析 按照TP-WB法讀取著色強(qiáng)度值將178例樣本進(jìn)行分析， A組34例著色強(qiáng)度50～170，B組38例著色強(qiáng)度24～90，C組106例著色強(qiáng)度24～50，組別及主成分分析聚類結(jié)果見(jiàn)表1及圖3。當(dāng)?shù)谝恢鞒煞譃?0.6%，第二主成分為3.9%時(shí)，將三組分別聚類分開(kāi)。分組因子貢獻(xiàn)分析見(jiàn)圖4所示，5個(gè)分組因子夾角為銳角，貢獻(xiàn)率從高到低依次為TPN15，TPN45，TPN17，TPN47和S/CO比 值。A組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均反應(yīng)性且著色強(qiáng)度高數(shù)值，顯示評(píng)價(jià)方法和比對(duì)方法陽(yáng)性符合率、總符合率為100%，具有高度一致性。B組，TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體陽(yáng)性率均減少，分別為92.1%，65.8%，86.8%和36.8%。TPN17和TPN47抗體陽(yáng)性率顯著降低（P＜0.05）。C組，TPN15和TPN17抗體表達(dá)為主。TP-WB法檢測(cè)30例結(jié)果反應(yīng)性（檢測(cè)出6例結(jié)果陽(yáng)性，24例結(jié)果可疑陽(yáng)性），76例結(jié)果陰性。TPPA法復(fù)驗(yàn)，檢測(cè)出96例結(jié)果1:80陽(yáng)性，10例結(jié)果陰性（TP-WB確證時(shí)，2例結(jié)果判定可疑）；TPPA與TP-WB法相比，顯示陽(yáng)性符合率29.2%。

表1 CMIA,TPPA,RPR,TP-WB及其抗體表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

圖3 TP-WB免疫印跡法樣本著色強(qiáng)度分組主成分聚類結(jié)果

圖4 TP-WB免疫印跡法樣本著色強(qiáng)度分組因子貢獻(xiàn)分析

3 討論

近年來(lái)，梅毒作為嚴(yán)重威脅公共健康的傳染性疾病之一[9-10]，具有極強(qiáng)的侵襲性，它通過(guò)黏附、定植、穿過(guò)組織屏障、累及全身各器官[11]。據(jù)報(bào)道，無(wú)癥狀梅毒的發(fā)生率高達(dá)64.6%以上[12]，盡管梅毒的發(fā)現(xiàn)和診治已有數(shù)十年的歷史，但是初期梅毒確診和晚期梅毒治療仍具有挑戰(zhàn)性[13]。TP侵入機(jī)體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)其不同抗原成分的抗體，主要包括抗心磷脂抗體和抗TP特異性抗體，是臨床血清學(xué)檢驗(yàn)診斷是否攜帶梅毒的基礎(chǔ)。TP蛋白是梅毒感染的重要因素，在感染梅毒時(shí)，檢測(cè)患者血清中的TP蛋白對(duì)梅毒的診斷具有重要價(jià)值[14].TP外膜蛋白是免疫的主要靶點(diǎn)，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)9種具有免疫活性的蛋白，即TPN15，TPN17，TPN33，TPN37，TPN39，TPN43，TPN45，TPN47和TPN97，而其中的TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)水平被認(rèn)為在梅毒的致病與診斷中起重要作用[15]。

TP是迄今為止無(wú)法在體外培養(yǎng)的病原微生物,感染后其表面的膜蛋白對(duì)宿主的固有免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的調(diào)控作用,因此被認(rèn)為是 TP重要的毒力因子[16-17]。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，TP膜蛋白的相關(guān)研究報(bào)道及應(yīng)用不斷涌現(xiàn)[18]。在蛋白質(zhì)印跡診斷測(cè)試中TPN45脂蛋白（TmpA; tp0768基因產(chǎn)物）和嵌合大腸埃希菌表達(dá)TPN15，TPN17，TP44.5和TPN47抗原（Meridian Life Science，Inc.，Memphis，Tennessee USA）作為免疫原性抗原的組合，被證實(shí)對(duì)獲得性梅毒具有高度敏感度和特異度[19]。其中TPN47，TPN17，TPN15以及TmpA脂蛋白具有強(qiáng)大的前炎癥活性，與TP引起的梅毒免疫反應(yīng)密切相關(guān)[20]。KUBANOV等[19]報(bào)道TPN15和TPN17免疫原性抗原是關(guān)鍵成員，在梅毒感染期間誘導(dǎo)高抗體反應(yīng)并且不與來(lái)自患有其他螺旋體病的患者的血清交叉反應(yīng)。CHAN等[21]提出TPN17在菌體外膜表面的分布具有隨意性的特點(diǎn)。它可能通過(guò)激活細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1），E-選擇素和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)，在蛋白質(zhì)配體結(jié)合，密螺旋體膜結(jié)構(gòu)維持[22]或梅毒發(fā)病機(jī)制中起作用。另一種強(qiáng)免疫原TPN47，具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)性，通過(guò)刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞間黏附分子并誘導(dǎo)血管細(xì)胞黏附分子在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮作用[19，23]。

本項(xiàng)研究中顯示活動(dòng)性梅毒患者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體均具反應(yīng)性且EUROLineScan軟件判讀結(jié)果著色強(qiáng)度數(shù)值高反應(yīng)性，與梅毒活動(dòng)進(jìn)展呈正相關(guān)性；CMIA檢測(cè)S/CO值＞15時(shí)，梅毒抗體單陽(yáng)者中免疫印跡梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47陽(yáng)性率均減少，其中TPN17和TPN47抗體陽(yáng)性率顯著降低（P＜0.05）；CMIA檢測(cè)S/CO值在1～9之間反應(yīng)性結(jié)果時(shí)，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)確認(rèn)顯示陽(yáng)性及可疑患者中TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體的表達(dá)明顯減少且反應(yīng)曲線著色強(qiáng)度均呈低水平。CMIA，TPPA與WB-Tp之間檢測(cè)結(jié)果不一致，其陽(yáng)性符合率僅為29.2%，并且臨床最終判定結(jié)果陽(yáng)性占20%（6/30），可疑陽(yáng)性結(jié)果占80%（24/30）。

綜上所述，基于重組脂蛋白技術(shù)的密螺旋體特異度檢測(cè)顯著改善了梅毒的診斷，為臨床實(shí)驗(yàn)室提供血清學(xué)檢測(cè)確證的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，梅毒患者分期處于不同的階段時(shí)，梅毒特異性抗體TPN15，TPN17，TPN45和TPN47抗體表達(dá)存在差異。當(dāng)梅毒血清初篩檢測(cè)結(jié)果弱反應(yīng)性以TPPA復(fù)核時(shí)，TPPA檢測(cè)結(jié)果并不能作為臨床確證的診斷，實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)確證方法應(yīng)首選梅毒免疫印跡法進(jìn)行確證。