空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR快速檢測

高正琴（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

空腸彎曲菌（Campylobabter jejuni）是一種微需氧、革蘭陰性螺旋形細菌，可寄生于胃腸道黏膜組織，是全世界細菌性食源性腸炎最常見的病因[1-4]?？漳c彎曲菌與不同的胃腸道疾病有關(guān)，包括腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、巴雷特食管和結(jié)腸直腸癌。感染后可引起菌血癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肺部感染、腦膿腫、腦膜炎，以及極少數(shù)受感染個體中被稱為格林-巴利綜合征（guillain-barre syndrome，GBS）和米勒-費希爾綜合征（miller fisher syndrome，MFS）的自身免疫性疾病。免疫缺陷者和免疫功能低下患者空腸彎曲菌感染的發(fā)生率較高，且表現(xiàn)為較嚴(yán)重的腹瀉和機體持續(xù)性疾病。該菌在組織中的存在與黏膜相關(guān)淋巴 組 織 瘤（mucosa associated lymmphoid tissue type，MALT）有關(guān)[5-10]。因此，在該菌感染早期就能夠快速準(zhǔn)確診斷病因，對疾病暴發(fā)流行的防控有著重要意義。盡管細菌學(xué)方法可檢出該菌，得出確定性診斷結(jié)論，然而其所需微需氧條件苛刻，分離鑒定耗時費力，無法滿足快檢要求。免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學(xué)方法可用于臨床樣本批量檢測，但因該菌與其他細菌抗原存在交叉反應(yīng)限制了此類方法使用。近年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、核酸雜交、生物芯片、基因測序等基因診斷技術(shù)在感染性疾病診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。因此，本研究建立了一種快速簡便、靈敏特異檢測空腸彎曲菌的TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR方法，聯(lián)合細菌培養(yǎng)和基因克隆測序鑒定技術(shù)，成功應(yīng)用于臨床標(biāo)本中空腸彎曲菌定量檢測，為疾病感染早期診療提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 1例臨床空腸彎曲菌感染腹瀉病人糞便由北京某醫(yī)院提供。25例小型豬腸內(nèi)容物、10例猴和10例犬糞便由北京某單位提供，32例地鼠腸內(nèi)容物由四川某單位提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 空腸彎曲菌ATCC 700819（NCTC 11168）購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所。腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）CMCC 50041小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌（Yersinia enterocolitica）CMCC 52302，福氏志賀菌（Shigella flexneri ）CMCC 51573、大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC 44711購自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心。含有空腸彎曲菌鞭毛蛋白A（flagellin A，flaA）基因和馬尿酸酶（hippuricase，hipO）基因的質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建保存，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA定量為4.0×1010拷貝/μl。

1.3 試劑和儀器 DNA小量提取試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品。TaqMan通用PCR 預(yù)混液為美國Life Technologies公司產(chǎn)品。無菌無核酶水為美國Progema公司產(chǎn)品。dNTP Mixture，EX Taq聚合酶、瓊脂糖、DNA Marker購自日本TaKaRa公司。Camp-BAP，Skirrow-BAP，mCCDA，Nutrient Broth No.2購自英國Oxoid公司。微厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)購自日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社。7500 Fast全自動熒光定量PCR儀、Verity 96 Thermal Cycler基因擴增儀購自美國Life Technologies公司。Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)購自東樂自然基因生命科學(xué)公司。生物安全柜購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 空腸彎曲菌分離和DNA提?。涸谏锇踩駜?nèi)，對臨床標(biāo)本作特定處理并經(jīng)微孔濾膜過濾去除大的雜菌和相關(guān)殘渣再接種Camp-BAP，mCCDA，Skirrow-BAP，于42℃微厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)48 h。挑取疑似菌落涂片鏡檢，實時動態(tài)顯微視頻攝錄菌體呈弧形作螺旋狀運動，將初步分離獲得的存活菌株純化后，轉(zhuǎn)種Nutrient Broth No.2于42℃微厭氧培養(yǎng)48 h，接種1.0%甘氨酸、3.5%氯化鈉肉湯、1%（w/v）馬尿酸鈉培養(yǎng)基和茚三酮溶液進一步鑒定。用DNA小量提取試劑盒提取臨床標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。

1.4.2 空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR引物探針設(shè)計和反應(yīng)體系的確立：根據(jù)GenBank中公布的空腸彎曲菌ATCC 700819（登錄號：NC_002163）fl aA基因和hipO基因序列設(shè)計實時熒光定量PCR引物和TaqMan-MGB探針，序列見表1。引物探針由美國Life technologies公司合成。

表1 空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR引物序列

在前期大量TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR研究工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，實現(xiàn)最佳擴增效率，選用的20 μl總反應(yīng)體積包括：TaqMan通用PCR預(yù)混液10 μl，探針引物1 μl，模板DNA 1μl，無菌無核酶水8 μl。反應(yīng)參數(shù)：50℃ 2 min，1個循環(huán)；95℃ 10 min，1個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。每次試驗均用無菌無核酶水作為陰性模板對照（negative template controls，NTC），空腸彎曲菌ATCC 700819 DNA作為陽性對照。用7500 Fast全自動熒光定量PCR儀檢測。實時觀察熒光信號采集試驗數(shù)據(jù)。使用儀器自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。閾值設(shè)定原則：閾值線超過陰性對照擴增曲線的最高點，且相交于陽性對照擴增曲線進入指數(shù)增長期的拐點，或根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。每個樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、特異度和靈敏度檢驗：取空腸彎曲菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA（4×1010拷貝/μl）進行10倍倍比稀釋，使之成為4×109拷貝/μl～4×100拷貝/μl，每個稀釋度取1 μl作為模板，各濃度梯度分別設(shè)3個平行重復(fù)孔，同上條件進行試驗，獲得系列標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以確定待測樣本中DNA含量[11]。

分別取1 μl空腸彎曲菌ATCC 700819、腸炎沙門氏菌CMCC 50041、小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌CMCC 52302、福氏志賀菌CMCC 51573、大腸埃希菌CMCC 44711 DNA作為模板同上條件進行試驗，驗證該方法的特異度。

用比濁法和平板計數(shù)法對空腸彎曲菌ATCC 700819進行計數(shù)，取4×109CFU/ml菌懸液進行10倍倍比稀釋，使之成為4×108CFU/ml～4×100CFU/ml，分別提取DNA作為TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR模板進行試驗，驗證該方法的敏感度。

1.4.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性檢驗：分別取1 μl質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA（4×106拷貝/μl～4×102拷貝/μl）為模板DNA，各濃度梯度分別設(shè)3個平行重復(fù)孔，同上條件進行試驗，統(tǒng)計分析組內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后取相同濃度質(zhì)粒DNA為模板，同上條件連續(xù)3天進行3次獨立的重復(fù)試驗，統(tǒng)計分析組間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗證該方法的重復(fù)性。

取本研究用探針引物、質(zhì)粒DNA及配套試劑，置于不同溫度（-70℃，-20℃，4℃），經(jīng)不同時間（90，180，360天），再同上條件進行試驗，用以考察該方法的穩(wěn)定性。

1.4.5 臨床標(biāo)本檢測 以臨床標(biāo)本和空腸彎曲菌分離株DNA為TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR模板同上條件進行試驗，同時進行普通PCR檢測、基因克隆和測序鑒定。

空腸彎曲菌普通PCR引物見表2。50 μl PCR反應(yīng)體系如下：10×Buffer （Mg2+Plus） 5.0 μl，dNTP Mixture 4.0 μl，正、反向引物各0.5 μl， EX Taq聚合酶0.25 μl，模板DNA 3.0 μl，無菌無核酶水37.25 μl。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃ 1 min，1個循環(huán)；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min，1個循環(huán)。每次試驗均用無菌無核酶水作為陰性模板對照，空腸彎曲菌ATCC 700819 DNA作為陽性對照。用Verity 96 Thermal Cycler基因擴增儀檢測。1%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果。陽性樣本進一步測序鑒定。

表2 空腸彎曲菌普通PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 線性擬合采用Excel軟件進行，相關(guān)及回歸分析采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 方法特異度和敏感度評價結(jié)果 空腸彎曲菌flaA基因和hipO基因模板DNA濃度在4×109拷貝/μl～4×100拷貝/μl范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示其擴增的相關(guān)系數(shù)為0.999,擴增效率為101%?；貧w方程：Y=-3.289X+39.667。

TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌ATCC 700819時出現(xiàn)特異性擴增曲線，Ct=25.96；腸炎沙門氏菌CMCC 50041、小腸結(jié)腸炎耶爾氏菌CMCC 52302、福氏志賀菌CMCC 51573、大腸埃希菌CMCC 44711均未出現(xiàn)特異性擴增曲線，Ct=Undet.。結(jié)果顯示，該方法專屬性強，能準(zhǔn)確檢出空腸彎曲菌，而與其他細菌無交叉反應(yīng)，特異度為100%。

用該方法檢測空腸彎曲菌ATCC 700819的DNA標(biāo)準(zhǔn)對照，定量線性范圍為4×108CFU/ml～4×100CFU/ml，均出現(xiàn)特異性擴增曲線，Ct值均小于35。結(jié)果表明，該方法檢測空腸彎曲菌最低檢測限可達4 CFU/ml，靈敏度高。標(biāo)準(zhǔn)曲線、特異性、敏感性結(jié)果見圖1。

2.2 方法重復(fù)性和穩(wěn)定性評價結(jié)果 如表3。該檢測方法相對組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.16%～0.77%之間，組間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%～0.64%之間，組內(nèi)和組間標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%。將TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR配套試劑置于不同溫度近1年未影響其使用性狀，試驗用酶、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品未發(fā)生降解，探針引物未出現(xiàn)熒光衰減現(xiàn)象，選取不同時間段測試相關(guān)系數(shù)和擴增效率未發(fā)生顯著變化。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性佳。

圖1 空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、特異度、敏感度試驗結(jié)果

表3 空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

2.3 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果 用本研究建立的TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR對臨床標(biāo)本進行空腸彎曲菌檢測，用陰性對照、陽性對照和靈敏度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品進行有效性驗證。質(zhì)量控制原則：陰性對照：未出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct=Undet；陽性對照：出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct≤30.0；靈敏度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct值在15.0～30.0之間，以上要求必須在同一實驗中同時滿足，否則本次實驗無效。檢驗結(jié)果的判定：當(dāng)待測樣本出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct≤35.0時為空腸彎曲菌核酸陽性；當(dāng)待測樣本未出現(xiàn)特異性擴增曲線或Ct=Undet時為空腸彎曲菌核酸陰性；對于Ct＞35.0的樣本，應(yīng)重新檢測，Ct值仍＞35.0的樣本判為陰性，Ct≤35.0的樣本判為陽性。78份臨床標(biāo)本經(jīng)檢測：28份標(biāo)本出現(xiàn)特異性擴增曲線且Ct＜30.0，判為空腸彎曲菌核酸陽性（圖2）。陽性標(biāo)本中空腸彎曲菌核酸載量在4×106拷貝/μl～4×102拷貝/μl之間。由圖可知，臨床病人標(biāo)本、猴、犬標(biāo)本中空腸彎曲菌核酸載量較高，小型豬、地鼠標(biāo)本中該菌核酸載量較低。臨床病人1例空腸彎曲菌陽性Ct值為15.71，猴4例Ct值分別為15.72，11.7，29.75和28.28。犬5例Ct值分別為13.59，12.73，12.97，29.28和21.74。小型豬12例Ct值分別為：27.54，26.84，27.1，26.79，28.19，28.02，28.51，27.21，26.95，28.19，26.03和27.41。地 鼠6例Ct值分 別 為：26.55，25.72，29.77，29.67，29.25和26.31。同時用普通PCR對這28例空腸彎曲菌核酸陽性標(biāo)本進行fl aA基因擴增，均出現(xiàn)1 719 bp特異性目的基因片段（圖3），分子量標(biāo)準(zhǔn)為100 bp DNA Ladder Marker。結(jié)果表明：普通PCR檢測結(jié)果與TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測結(jié)果相一致。用細菌學(xué)檢查方法僅從臨床病人、猴、犬、小型豬陽性標(biāo)本中分離獲得6株存活的空腸彎曲菌。用普通PCR均可擴增出這6株空腸彎曲菌fl aA基因特異性片段，目的片段經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定，陽性菌液測序，序列分析比對結(jié)果顯示與GenBank中已公布的空腸彎曲菌fl aA基因序列同源性達100%，確證為空腸彎曲菌。

圖2 TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

圖3 普通PCR檢測臨床樣本中空腸彎曲菌結(jié)果

3 討論

空腸彎曲菌菌株NCTC 11168于1977年保存在國家菌種保藏中心（national collection of type cultures，NCTC），是第一個完整發(fā)表基因組的彎曲桿菌[12-13]。目前尚未見國內(nèi)外有用TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR特異性檢測空腸彎曲菌的報道。本研究針對空腸彎曲菌fl aA和hipO基因分別設(shè)計兩套引物探針，應(yīng)用TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床標(biāo)本，有效克服了單基因覆蓋面不全的問題，同時用普通PCR、基因克隆測序驗證，細菌分離培養(yǎng)確證，避免產(chǎn)生假陽性和假陰性結(jié)果，有效保障了臨床標(biāo)本檢測的可靠穩(wěn)定性。在本研究抗干擾檢測中，用腸炎沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、福氏志賀菌、大腸埃希菌等相關(guān)感染性腹瀉腸道致病菌進行TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測，均未出現(xiàn)特異性擴增曲線，顯示該方法檢測空腸彎曲菌特異性較強?？漳c彎曲菌的感染致病劑量約為102CFU/ml，而分離培養(yǎng)檢出限約為104CFU/ml，在本研究中空腸彎曲菌最低檢測限可達4 CFU/ml，靈敏度高，完全符合臨床復(fù)合標(biāo)本特定檢驗要求。本方法能在得到樣本后2 h得出檢測結(jié)果，大大縮短了檢測所需時間，真正實現(xiàn)了快速診斷。應(yīng)用本研究建立的TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR方法從78例臨床標(biāo)本中檢出28例陽性標(biāo)本，而分離培養(yǎng)只是獲得6株存活的空腸彎曲菌，原因是多方面的。將空腸彎曲菌與其他彎曲菌的種區(qū)別開來的主要試驗是馬尿酸鈉水解試驗。在42℃下，用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)到的菌株，氧化酶陽性，具有顯微鏡下的形態(tài)學(xué)特征，并且馬尿酸鈉水解試驗陽性，即可確定為空腸彎曲菌。在特定的時空下，空腸彎曲菌某些菌株馬尿酸酶基因處于不分泌或表達下調(diào)狀態(tài)，生化鑒定時馬尿酸鈉水解試驗可能呈現(xiàn)陰性或弱陽性，這樣勢必會造成這些菌株的漏檢[14-15]。空腸彎曲菌分離培養(yǎng)所需微厭氧條件比較特殊，暴露于有機酸低溫氧化等多種脅迫條件下，該菌則易變?yōu)榍蛐位蚧畹姆强膳囵B(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturable state，VBNC），加之臨床抗生素治療也會抑制該菌生長，使其分離培養(yǎng)率低[16-17]。BEROAL等[18]最近報道住院腹瀉患者糞便彎曲桿菌PCR檢測呈陽性而培養(yǎng)結(jié)果呈陰性，指出PCR陽性結(jié)果應(yīng)在評估非感染性腹瀉相關(guān)條件后在臨床環(huán)境中解釋但不能作為單獨的診斷工具。

綜上所述，本研究建立的空腸彎曲菌TaqMan-MGB雙重探針實時熒光定量PCR檢測方法，具有快速簡便、特異度強、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性佳的特性，該方法的建立對食品藥品生物制品中空腸彎曲菌的安全性檢驗具有重要價值，同時也為疾病感染早期快速診斷、滿足快速應(yīng)急檢驗需要、開展分子流行病學(xué)調(diào)查提供了新的技術(shù)手段，值得推廣使用。