氮、磷添加對青藏高原高寒草甸叢枝菌根真菌群落的影響

林 昕，董 強，王 平，姜麗麗，胡嘉麗，汪詩平,3，紀寶明

(1 北京林業(yè)大學 草業(yè)與草原學院，北京 100083； 2 中國科學院 青藏高原研究所/中國科學院 高寒生態(tài)院重點實驗室，北京 100101； 3 中國科學院 青藏高原地球科學卓越創(chuàng)新中心，北京 100101)

叢枝菌根真菌 (Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是屬于球囊霉門Glomeromycota的專性共生微生物，可以與陸地80%以上的植物根系共生。AMF自身生長所需的碳源完全依賴宿主植物，作為回饋，它們可以幫助宿主吸收礦質營養(yǎng)，提高宿主植物對生物及非生物脅迫的抗性[1]。研究發(fā)現AMF對植物種群、群落甚至是草地生態(tài)系統(tǒng)都有重要的調控作用[2-4]。

高寒草甸是青藏高原東南部主要的草地類型[5]，其主要建群植物為莎草科嵩草屬的小嵩草Kobresia pygmaea、矮嵩草K. humilis、線葉嵩草K.capillifolia和藏嵩草K. tibetica等[6-7]，因此也稱作高寒嵩草草甸。莎草科植物一直被認為是非叢枝菌根植物，但有研究發(fā)現在青藏高原AMF可以與嵩草屬植物共生[8-9]，并對土壤團聚體的形成起重要作用[10]。基于AMF在草地生態(tài)系統(tǒng)中的重要性以及高寒嵩草草甸在青藏高原草地中所占的比例，研究高寒嵩草草甸生態(tài)系統(tǒng)中AMF的群落構建及動態(tài)對深入理解青藏高原草地土壤?植被相互作用具有重要意義。

近幾十年來，受全球氣候變暖和人類活動加劇的影響，青藏高原約1/3的草地發(fā)生了不同程度的退化[11]。施肥是退化草地恢復的有效方式之一，目前關于養(yǎng)分添加(主要是氮和磷)能否及如何影響高寒草甸AMF群落的研究相對稀少，并且僅限于海拔不超過 3 500 m 的區(qū)域[12-14]，不能代表海拔為 3 200～5 200 m的青藏高原高寒嵩草草甸[7]。目前基于傳統(tǒng)形態(tài)鑒別[15]和分子測序[16]的研究表明，隨海拔提升，AMF侵染率、孢子數量和物種豐度下降，AMF群落組成也隨之變化。不同海拔高度AMF群落對施肥的響應可能不同，為了更全面地認識高寒草甸，有必要選擇海拔更高的區(qū)域進行研究。

本試驗選取海拔約4 500 m的高寒嵩草草甸施肥樣地，研究不同氮、磷添加對青藏高原高寒嵩草草甸AMF群落的影響及潛在驅動因子。本研究的核心科學問題為探究高寒嵩草草甸根系AMF群落對氮、磷添加的響應機制，及在添加氮、磷條件下主導AMF群落變化的因素。

1 研究區(qū)概況和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于中國科學院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境觀測站 (E91°12′～93°02′，N30°31′～31°55′)，屬于西藏那曲東南部，海拔 4 480 m，年平均氣溫?2.1 ℃，年平均降水 406.2 mm，高原山地氣候，土壤類型為始成土，主要植物種類有小嵩草、矮嵩草和藏薹草Carex thibetica等。

1.2 樣地設計及取樣

2013 年設置了 48 個 5 m × 5 m 的小區(qū)，完全隨機設計，3個施氮梯度，4個施磷梯度，4次重復。施用的氮肥為尿素，各處理每年施用量分別為0、7.5、15.0 g·m?2，分別記為 N0、N1 和 N2。施用的磷肥為過磷酸鈣，有效成分為P2O5，各處理每年P2O5施用量分別為 0、7.5、15.0、30.0 g·m?2，分別記為 P0、P1、P2和P3。每年7月末施肥1次。

2016年8月18日，在每個小區(qū)隨機挑選1個植被覆蓋度相似的點作為樣點。用土鉆從每個樣點均取深20 cm、直徑8 cm的土塊。將土塊過2 mm篩，去除土和石塊，將保留的根系裝入自封袋作為1份樣品，?20 ℃保存。另取部分過篩的土裝入自封袋，4 ℃保存。共計取得48份根系樣品和48份土壤樣品，冷藏運送至北京林業(yè)大學草地資源與生態(tài)實驗室。在進行后續(xù)試驗分析前，將所有根系樣品室溫解凍，然后用清水洗凈。

1.3 土壤化學成分分析

取適量土壤樣品進行土壤化學成分分析。土壤有機碳用重鉻酸鉀滴定法[17]測定；土壤全氮用凱氏定氮法[18]測定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮均用 1 mol·L?1的氯化鉀溶液浸提，然后用紫外分光光度法[19]測定；土壤全磷和有效磷分別用高氯酸?硫酸和碳酸氫鈉浸提，并用鉬?銻比色法[20-21]測定；pH在水土質量比為2.5∶1的條件下測量。

1.4 叢枝菌根真菌侵染率測定

根據Brundrett等[22-23]的方法，先從每份根系樣品中剪取若干長1.5 cm的幼嫩根段，用臺盼藍染色。染色后在每份樣品中挑出30個根段，切成1 cm根段，然后將每10個根段平行地放置在載玻片上，滴加乳酸甘油制片，每份樣品制作3個玻片。在200×顯微鏡下根據McGonigle等[24]的方法測定AMF侵染率。

1.5 叢枝菌根真菌DNA提取、擴增及測序

在每份根系樣品中，剪取40根長1 cm的幼嫩根段，用CTAB法[25]提取其中的DNA。提取出的DNA用無菌去離子水稀釋20倍作為DNA原液，然后進行巢式PCR擴增。2輪PCR的反應體系均為 25 μL：2 × Pfu PCR MasterMix (KP201) 12.5 μL，無菌去離子水 8.5 μL，DNA 模板 2 μL 以及 2個引物各1 μL。第1輪PCR使用的引物為NS31(5′-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′)和 AML2(5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′)，反應條件：94 ℃ 預熱 3 min；94 ℃ 變性 45 s，53 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 45 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。第1輪PCR的產物稀釋至1/10作為第2輪PCR的模板。第2輪PCR使用的引物為AMV4.5NF(5′-AAGC TCGTAGTTGAATTTCG-3′)和 AMDGR(5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)[26]，其中AMDGR的5′端帶有由12個堿基組成的barcode。第2輪PCR反應條件與第1輪PCR相同，所得的產物用 10 g·L?12 × TAE 的瓊脂糖凝膠進行電泳(電壓 120 V，時間 30 min)檢測。若樣品有目標DNA 條帶 (約 280 bp)檢出，取 4 μL 第 2 輪 PCR模板用2倍的反應體系進行第2輪PCR。若樣品無目標條帶檢出，用該樣品的DNA原液重復巢式PCR，若2次重復均無目標條帶，則去除該樣品。根據此方法N1P1處理中的1個樣品無條帶，去除后剩余47個樣品。切取含目標條帶的凝膠，使用DNA膠純化試劑盒(Axygen，美國)進行DNA純化。純化后的DNA使用Nanodrop 8000超微量分光光度計測定濃度，根據測定的濃度用移液槍從每個樣品中吸取含100 ng DNA的溶液混合至1個離心管，送至中國科學院成都生物研究所在Illumina Miseq平臺進行高通量測序。

1.6 生物信息學分析

測序得到的原始數據使用QIIME[27]進行分析。首先對數據進行質量控制，最大錯誤期望=0.5，最短序列長度=200，然后依次去除重復、chimeras和singletons。使用UPARSE-OTU算法和Silva數據庫，依據97%的相似度閾值劃分代表OTU并制作OTU表。在Excel中除去不屬于球囊霉門、出現的樣本數少于3以及序列數小于總序列量0.01%的OTU，并刪除序列數小于總序列1%的樣品以降低誤差。對所有樣品根據最小的樣本序列量進行重新抽樣，以減小樣本量不同造成的差異。此外，將代表OTU序列上傳至NCBI，與GenBank的已有序列進行比對，獲得相近的參考序列。使用代表序列和參考序列在MEGA 7中使用p-distance模型，在bootstrap值為1 000下構建鄰接樹，直觀查看代表OTU的系統(tǒng)發(fā)生情況。本研究獲得的代表OTU序列均上傳至歐洲核苷酸檔案庫，序列號為LR535994～LR536029。

1.7 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計OTU數量作為OTU豐度，并計算AMF各科在各樣品和各處理中的相對豐度。在R(3.2.2)中使用Vegan包中diversity功能計算每個樣品的Shannon多樣性指數。

進行方差分析前，將數據進行轉換以符合數據分布的正態(tài)性和方差同質性。其中，對土壤化學成分、OTU豐度和Shannon多樣性指數數據進行對數轉換，侵染率和AMF科相對豐度數據作反正弦平方根轉換。轉換后的數據在JMP 11中進行雙因素方差分析，分析氮、磷添加是否顯著影響以上數據，具有顯著差異(P＜0.05)的結果使用Tukey's HSD檢驗進行多重比較。

在群落分析前，先應用R對OTU?樣品矩陣進行Hellinger轉換以減少稀有OTU的影響，然后用vegdist功能將矩陣轉化為Bray-Curtis矩陣。在R中使用Vegan包中的adonis功能進行PerMANOVA分析，研究施氮、磷和其交互作用對AMF群落組成的影響。將土壤化學成分數據作為環(huán)境變量導入R并轉化為Euclidean矩陣，與之前的群落矩陣一起進行Mantel分析，以研究土壤化學成分與AMF群落組成的關系。

最后，進行排序分析以研究不同處理AMF的群落分布情況。首先用原始的OTU?樣品矩陣進行去趨勢對應分析，根據排序軸長結果進一步使用典范對應分析，并用envfit功能進行Monte Carlo檢驗找出與AMF群落分布有顯著相關的環(huán)境因子。最終使用ggplot包進行畫圖，直觀顯示各處理下AMF群落分布及其和環(huán)境因子的關系。

2 結果與分析

2.1 土壤化學成分

方差分析得出，不同施氮處理銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量差異均極顯著(P＜0.001)；不同施磷處理全磷和有效磷含量也有極顯著(P＜0.001)差異；氮、磷添加的交互作用對硝態(tài)氮和有效磷含量有顯著(P=0.021，P=0.040)影響 (表1)。其中，N2處理銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量高于N0和N1處理；P3處理全磷和有效磷量高于其余施磷處理，P2處理有效磷含量高于P0處理(表2)。氮、磷添加及其交互作用未對土壤有機碳、全氮和pH產生顯著影響(表1)。

表1 不同施肥處理土壤化學成分含量差異顯著性分析Table 1 Significance analyzes of soil chemical component content differences in different fertilization treatments

表2 不同施肥處理試驗樣地的土壤化學成分含量1)Table 2 Soil chemical component contents of the experiment field in different fertilization treatments

2.2 叢枝菌根真菌侵染率

如圖1所示，根系樣品AMF侵染率平均值為73.1%。方差分析結果表明，氮、磷的施加及其交互作用對 AMF 侵染率無顯著 (P= 0.350，P= 0.119，P=0.562)影響。

2.3 測序總體結果

測序數據除雜后，剩余43個樣品，共獲得234 041條AMF序列。每個樣品序列數從297至15 397不等。將所有樣品重新抽樣至樣本量為297后，獲得36個OTU，每個樣品的OTU數量從1至12個不等，平均值為5.6個。根據稀釋曲線(圖2)可以看出，重新抽樣后 N0P2、N1P0、N1P3、N2P2和N2P1對應的曲線末端趨于平滑，說明測序深度較為飽和。經比對，所有AMF的OTU分屬7個科，其中球囊霉科有27個OTU，10 285條序列，占總序列的80.5%；多孢囊霉科Diversisporaceae有3個OTU，666條序列，占總序列的5.2%；碎球囊霉科Claroideoglomeraceae有2個OTU，146條序列，占總序列的1.1%；無梗囊霉科Acaulosporaceae、原囊霉科Archaeosporaceae、巨孢囊霉科Gigasporaceae和和平囊霉科Pacisporaceae各有1個OTU，序列數分別為441、532、351和350條，共占總序列的13.1%(圖3)。根據OTU代表序列和參考序列構建的鄰接樹如圖4所示。

圖1 不同施肥處理下叢枝菌根真菌侵染率Fig. 1 Arbuscular mycorrhizal fungal colonization rates in different fertilization treatments

圖2 不同施肥處理下分子測序的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curve of sequencing samples in different fertilization treatments

圖3 不同施肥處理下叢枝菌根真菌各科的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of different arbuscular mycorrhizal fungal families in different fertilization treatments

圖4 36個叢枝菌根真菌OTU代表序列及其參考序列構建的鄰接樹Fig. 4 Neighbor-joining tree constructed based on representative sequences of 36 arbuscular mycorrhizal fungal OTUs and their reference sequences

2.4 氮、磷添加對叢枝菌根真菌群落的影響

方差分析結果顯示，氮、磷添加及其交互作用對OTU豐度和Shannon多樣性指數無顯著影響(圖5A、5B)。但施氮對球囊霉科的相對豐度有顯著影響(P＜0.001)，N2處理球囊霉科的相對豐度顯著低于N1(圖5C)。

PerMANOVA結果表明氮、磷添加處理及其交互作用對AMF群落組成無顯著影響(P = 0.680，P=0.473，P= 0.589)。Mantel分析結果顯示 AMF 群落組成與有機碳含量和硝態(tài)氮含量有顯著正相關(r=0.176,P=0.110；r=0.142,P=0.041)關系。此外，Monte Carlo結果表明有機碳、硝態(tài)氮、全磷和有效磷含量均對AMF群落結構有顯著影響(r=0.04,P=0.001；r=0.327,P=0.013；r=0.185,P=0.025；r=0.188,P=0.020)。這4個環(huán)境因子在典范對應分析中對排序結果的解釋量為11.70%，第1軸和第2軸的解釋量分別為6.13%和2.61%。(圖6)。

圖5 不同施肥處理叢枝菌根真菌OTU豐度、Shannon多樣性指數及球囊霉科相對豐度Fig. 5 OTU richness, Shannon diversity index of arbuscular mycorrhizal fungi and relative abundance of Glomeraceae in different fertilization treatments

圖6 不同施肥處理叢枝菌根真菌群落以及顯著環(huán)境變量的典范對應分析圖Fig. 6 Canonical correspondence analysis plot of arbuscular mycorrhizal fungal community distribution and significant environmental variables among different fertilization treatments

3 討論與結論

在農田和天然草地生態(tài)系統(tǒng)中，施加氮和磷會降低AMF侵染率、OTU豐度和多樣性，改變根系和根際土壤中AMF的群落結構[28-29]。研究認為出現這種現象的原因是土壤養(yǎng)分的增加使植物更多依靠自身根系去吸收營養(yǎng)，降低對幫助其吸收養(yǎng)分的微生物的依賴[30]。本研究發(fā)現，施氮顯著提高了土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量，施磷顯著增加了土壤中全磷和有效磷的含量，但氮、磷的施加對AMF侵染率、OTU豐度、多樣性以及群落組成均無顯著影響。因此，本研究的結果與此前在其他生態(tài)系統(tǒng)下的研究結果存在差異[28-29]，該差異可能是由以下原因造成的。

首先，差異可能是海拔不同造成的。目前相關研究[12-14]的海拔不超過3 500 m，低于本試驗樣地的海拔4 480 m。海拔會顯著影響AMF的群落和功能，Gai等[15]和Shi等[31]通過形態(tài)學方法發(fā)現不同海拔條件下AMF侵染率、孢子密度以及菌絲密度都會有顯著變化；Liu等[16]和Li等[32]通過分子測序手段發(fā)現不同海拔條件下AMF群落組成有顯著差異。本研究與此前研究的海拔不同，氣候、植被及土壤條件都會有不同，進而導致AMF對氮、磷添加的差異性響應。

第二，在高寒地區(qū)AMF不僅能幫助植物進行養(yǎng)分吸收，同時也可幫助植物應對環(huán)境脅迫。因此即使在施肥條件下植物不需要AMF來幫助其獲取養(yǎng)分，還是要與AMF保持共生關系應對脅迫。Xiang等[13]在海拔3 220 m的青藏高原高寒草地施肥3年，發(fā)現同時添加氮和磷時AMF的OTU豐度和多樣性均顯著高于對照，也高于氮、磷單獨添加時的水平。Chen等[33]研究認為，雖然在養(yǎng)分充足的條件下，植物在營養(yǎng)吸收上降低了對AMF的依賴，然而，植物依然需要AMF來幫助其對抗環(huán)境脅迫，尤其是球囊霉科可以提高宿主抗寒性。在本研究的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中，一方面氮、磷的添加使得植物群落降低了對AMF吸收養(yǎng)分的依賴，另一方面植物群落卻增加了依靠AMF來對抗脅迫的需要。因此，2個效應綜合使得在氮、磷添加的情況下AMF的OTU豐度、多樣性和群落組成未受顯著影響。

另一個可能引起差異的原因是樣品內及樣品間的差異較大，影響了氮、磷添加的效應。從稀釋曲線可以看出，個別樣品的曲線在終點處仍在上升，說明其測序深度未達到飽和，此時增加取樣量可能會有更多的OTU出現。同時，通過典范對應分析圖可以直觀地發(fā)現，N2P3處理3次重復的AMF群落分布距離較大，該處理3次重復的AMF群落的差異是所有處理的重復間差異最大的。基于樣本內的誤差，本試驗結果存在一定限制性。

本研究中，PerMANOVA分析發(fā)現，施加氮、磷不影響AMF群落組成，但通過Mantel分析發(fā)現AMF群落的組成與有機碳和硝態(tài)氮含量有顯著的正相關關系。典范對應分析的結果表明有機碳、硝態(tài)氮、全磷和有效磷含量與AMF群落的分布有顯著的正相關關系，其中有機碳與AMF群落分布的相關性最大。有機碳主要對低磷條件(P0和P1處理)AMF群落有影響，硝態(tài)氮、全磷和有機碳主要對高磷條件(P3處理)AMF群落有影響。相關研究也表明，土壤有機質、硝態(tài)氮和有效磷均是對高寒草甸AMF群落有顯著影響的土壤成分[34-35]。

Zheng等[34]發(fā)現施氮能改變AMF群落，但不是通過直接作用，而是間接地通過改變土壤其他成分(如有機碳)和植物群落來影響AMF群落。土壤成分也可以直接或間接地影響微生物群落[36-37]。因此可以解釋本研究中施肥未對AMF群落產生影響，但特定的土壤因子與AMF群落分布有顯著相關性。

綜上所述，基于青藏高原4 500 m海拔高寒草甸的研究發(fā)現，氮、磷添加對AMF的侵染率、OTU豐度和多樣性無顯著影響。該發(fā)現回答了本研究要明確的第1個核心科學問題，即青藏高原高寒嵩草草甸根系中的AMF群落不受氮、磷添加的影響，與海拔較低的AMF群落對氮、磷的響應不同；對第2個核心科學問題，影響青藏高原高寒嵩草草甸根系AMF群落的因子主要是有機碳和硝態(tài)氮含量，全磷和有效磷含量是次要因子。未來研究還需要系統(tǒng)選取不同海拔的樣地，以獲取青藏高原不同海拔高寒草甸AMF群落對施肥的響應。另外，在全面剖析AMF群落變化規(guī)律及驅動機制的基礎上，亟需研究AMF群落變化如何反饋影響地上植被的個體生長與群落動態(tài)，探索高寒草地退化及恢復演替中的地下生態(tài)過程及機理。