結(jié)腸癌SAE2表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

劉昭詩，賴人旭*，任江南，麥蕾，高敏照

(1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，珠海 519000; 2中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院消化內(nèi)科，珠海 519000)

結(jié)直腸癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率位居第三，死亡率位居第五[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率及病死率均上升至惡性腫瘤的前五位[2]。小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-like modi fier，SUMO）修飾作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種，遍及體內(nèi)細(xì)胞代謝的眾多過程[3],在細(xì)胞離子通道和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、細(xì)胞遷移和凋亡中，SUMO發(fā)揮著重要的作用[4]。SAE2是SUMO化激活酶E1的亞基之一[5]，其異常表達(dá)可導(dǎo)致SUMO化途徑的失調(diào)。研究表明，SAE2的表達(dá)水平與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有著密切的關(guān)系，但有關(guān)其與結(jié)腸癌關(guān)系的研究較少。本文回顧性分析了93例結(jié)腸癌組織及相對(duì)應(yīng)的71例癌旁正常組織中SAE2的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

材料與方法

1 研究對(duì)象

收集2010年1月至2014年12月在中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院就診并接受手術(shù)治療的164例結(jié)腸病理組織（其中結(jié)腸癌組織標(biāo)本93例，相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本71例，22例結(jié)腸癌病例無癌旁組織），所有結(jié)腸癌組織經(jīng)病理證實(shí)為R0切除（即手術(shù)切緣鏡下觀察陰性）。納入標(biāo)準(zhǔn)包括手術(shù)切除的腫瘤病灶、經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為原發(fā)性結(jié)腸癌、具有完整臨床資料、無術(shù)前放療和化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)包括原位癌（高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變）、直腸及盲腸和肛管惡性腫瘤、結(jié)腸轉(zhuǎn)移性癌、同時(shí)存在其他部位原發(fā)惡性腫瘤、遺傳性非息肉病性結(jié)腸癌。

2 病例臨床特征

結(jié)腸癌患者醫(yī)療記錄內(nèi)容包括：社會(huì)人口學(xué)特征如年齡、性別等；臨床病理資料如腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、分化程度、腸壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后有無放化療等。腫瘤病理分期標(biāo)準(zhǔn)：采取美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)或國際聯(lián)合抗癌委員會(huì)（UICC/AJCC）的結(jié)腸癌（第七版）TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)腸癌病理分期。解剖分布根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)的第三版腫瘤分類法分為3組：右半結(jié)腸（包括升結(jié)腸、結(jié)腸肝曲、橫結(jié)腸）組、左半結(jié)腸（包括結(jié)腸脾曲、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸）組、其他（跨越多個(gè)腸段等）組。

3 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)PV-6000二步法檢測SAE2的表達(dá)，所使用的第一抗體為兔抗人SAE2多克隆抗體（1:100；Abcam公司，ab58451），以PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照，以抗體說明書指示的肺腺癌組織（SAE2表達(dá)陽性）作為陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色的強(qiáng)度和面積作為SAE2蛋白表達(dá)程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí)：無染色或染色面積＜10%為SAE2（0）；染色模糊且可見染色面積大于10%為SAE2（1+）；中等染色面積大于10%為SAE2（2+）；強(qiáng)染色面積大于10%為SAE2（3+）（由兩名病理醫(yī)生雙盲法10倍物鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野；SAE2 0～1+為表達(dá)陰性表達(dá)，SAE2 2+～3+為表達(dá)陽性表達(dá)）。

4 隨訪記錄

隨訪資料記錄內(nèi)容：隨訪起始時(shí)間為手術(shù)治療日期；隨訪截止日期為2018年2月28日；終點(diǎn)事件是患者的主要死因?yàn)榻Y(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或結(jié)腸癌相關(guān)并發(fā)癥；完全數(shù)據(jù)是指隨訪起始至終點(diǎn)事件出現(xiàn)；生存時(shí)間均以月為單位記錄。計(jì)算病人1年、3年和5年生存率，如果病人生存時(shí)間超過1年，則將截?cái)鄷r(shí)間定義為1年；若病人因非腫瘤因素導(dǎo)致死亡或中途失訪，生存時(shí)間即為截?cái)鄷r(shí)間；如果病人生存時(shí)間短于1年，則為發(fā)生終點(diǎn)事件。3年和5年生存率以此類推。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SAE2的組間表達(dá)的差異比較應(yīng)用分類變量的χ2檢驗(yàn)；臨床病理因素應(yīng)用Kaplan-Meier單因素生存分析、Log-Rank法檢驗(yàn)；應(yīng)用 Cox 回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型篩選影響結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SAE2在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)

SAE2在93例結(jié)腸癌標(biāo)本中34例為陽性表達(dá)，59例為陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率為36.6%（34/93）；在71例癌旁正常結(jié)腸標(biāo)本中2例為陽性表達(dá)，69例為陰性表達(dá)，陽性表達(dá)率為2.8%（2/71）。將結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織鏡下觀察結(jié)果對(duì)比顯示：SAE2表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織標(biāo)本中較癌旁正常組織標(biāo)本高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.756，P＜0.001）（圖 1和表1）。

2 SAE2表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理因素相關(guān)

SAE2陽性表達(dá)率在不同性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。不同Dukes分期中，C+D期者SAE2陽性表達(dá)率為53.5%，A+B期者為22.0%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.956，P＜0.001）。不同TNM分期中，SAE2陽性表達(dá)率在I期、II期、III期、IV期分別為0%、29.4%、32.4%、38.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.480，P＜0.05）。SAE2陽性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為51.4%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為27.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.350，P＜0.05）。SAE2陽性表達(dá)率在有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者為68.4%，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者為28.4%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.452，P＜0.001）（表2）。

圖1 SAE2在結(jié)腸/結(jié)腸癌組織中的表達(dá)。A，陰性對(duì)照組；B，陽性對(duì)照組；C，SAE2(0)；D，SAE(1+)；E，SAE(2+)；F，SAE(3+)；比例尺，20μmFig.1 Expression of SAE2 in normal colon/colon cancer tissue. A, negative control；B, positive control；C, SAE2(0)；D, SAE(1+)；E, SAE(2+)；F,SAE(3+); scale bar, 20μm

表1 SAE2在結(jié)腸癌和癌旁正常組織的表達(dá)Tab. 1 The expression of SAE2 in colon cancer and adjacent normal tissues

表2 SAE2與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系Tab. 2 Relationship between SAE2 and clinicopathological factors of colon cancer

3 SAE2表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)

進(jìn)行隨訪的93例結(jié)腸癌患者中，最短隨訪時(shí)間為0個(gè)月，最長隨訪時(shí)間為95個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為41.0個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為40.73個(gè)月，中位生存時(shí)間為26.00個(gè)月。直至2018年2月28日隨訪停止時(shí)，有65個(gè)受訪者仍然存活。生存期超過5年的有24例，占患者總數(shù)的25.8%。有29例發(fā)生死亡，其中有28例死于結(jié)腸癌所致的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、并發(fā)癥等，另有1例為因其他疾病死亡。有6名受訪者在發(fā)生了復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后，直到隨訪截止時(shí)仍然存活。

低年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、76%，而高年齡組1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為80%、54%、52%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Dukes分期為A+B期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、93%、90%，C+D期者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、45%、32%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。TNM分期為I期者5年生存率達(dá)100%，II期、III期、IV期者1年生存率分別為100%、94%、67%，3年生存率85%、69%、26%，5年生存率71%、69%、7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。腫瘤浸潤深度為T1+T2期、T3期、T4期1年生存率分別為100%、96%、76%，2年生存率分別為80%、82%、49%，5年生存率分別為80%、76%、35%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為98%、86%、80%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為77%、48%、36%，較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的生存率下降，以5年生存率下降最為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為90%、83%、68%，而有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者生存率明顯下降，其1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為30%、10%、10%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。SAE2表達(dá)陰性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為96%、86%、80%， SAE2表達(dá)陽性者1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為81%、50%、41%，5年生存率降低更為明顯，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（表3和圖2）

4 SAE2是結(jié)腸癌患者生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素

將單因素分析所得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入Cox多元回歸模型表4所示，不同Dukes分期、不同浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對(duì)生存時(shí)間影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。SAE2表達(dá)陽性者較陰性者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高（P＜0.05）。高年齡組較低年齡組死亡風(fēng)險(xiǎn)升高（P＜0.05）。高TNM分期者較低TNM分期者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高（P＜0.05）（表4）。

表3結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognosis in patients with colon cancer

討 論

研究表明，SAE2的表達(dá)水平與多種腫瘤細(xì)胞如骨肉瘤細(xì)胞、乳腺癌、肝癌細(xì)胞、膽管癌、肺癌等的增殖、遷移和侵襲有著密切的關(guān)系[6-11]，且SAE2的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期和腫瘤分化程度相關(guān)[12]，同時(shí)與患者的生存預(yù)后成一定相關(guān)性，但與結(jié)腸癌關(guān)系尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法對(duì)164例結(jié)腸組織標(biāo)本中SAE2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)93例結(jié)腸癌標(biāo)本中陽性表達(dá)率達(dá)到36.6%（34/93），而在71例對(duì)應(yīng)的癌旁正常標(biāo)本中陽性表達(dá)率僅為2.8%（2/71），結(jié)腸癌組織中SAE2的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SAE2在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，提示著SAE2可能是結(jié)腸上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的重要環(huán)節(jié)，有望成為結(jié)腸癌診斷和治療的靶標(biāo)。

圖2 結(jié)腸癌患者生存狀況的Kaplan-Meier單因素分析Fig. 2 Kaplan-Meier univariate analysis of survival status of colon cancer patients

表4 影響患者預(yù)后的Cox多元回歸分析Table 4 Cox multivariate regression analysis of prognosis in patients

在Shao[13]的研究中，SAE2的表達(dá)與腫瘤浸潤的深度、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、患者的TNM分期有著明顯的相關(guān)性，胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移潛力在敲除SAE2降低其表達(dá)后得到減弱。而在Liu[11]課題組中，實(shí)驗(yàn)表明降低SAE2的表達(dá)后，不僅可以延緩肺癌細(xì)胞的生長、增加其凋亡的發(fā)生，還可降低腫瘤的遷移能力和侵襲性。Cheng[14]和Ji[15]的研究結(jié)果顯示，SAE2可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響結(jié)直腸癌或胃癌腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移。以上結(jié)果均表明SAE2與腫瘤的發(fā)生和侵襲性密切相關(guān)，但目前國內(nèi)外對(duì)SAE2與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系研究較少且不深入。在本研究中，93例隨訪對(duì)象被按年齡、性別、Dukes分期、TNM分期、腫瘤部位及大小、浸潤深度、分化程度、病理類型等分為不同亞組。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)不同亞組中結(jié)腸癌患者臨床病理資料以及SAE2的表達(dá)水平進(jìn)行分析后結(jié)果顯示：SAE2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、病理類型無關(guān)，與患者的Dukes分期、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)?；颊叩腄ukes分期越晚，SAE2陽性表達(dá)率越高，C+D期的患者SAE2陽性表達(dá)率高于A+B期。同時(shí)，隨著TNM分期增加SAE2陽性表達(dá)率也在增加，I期、II期、III期、IV期患者的SAE2陽性表達(dá)率呈現(xiàn)遞增趨勢（I期為0%、II期為29.4%、III期為32.4%、IV期為38.2%），IV期的陽性表達(dá)率最高，顯著高于陽性率為0%的I期患者。SAE2的陽性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中顯著高于無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。在腫瘤浸潤深度上，SAE2的陽性表達(dá)率隨著浸潤深度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，T1+T2中SAE2陽性率為16.7%，T3中SAE2陽性率為33.9%，T4中SAE2陽性率為48.0%，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與所收集的組織標(biāo)本主要集中在T3分期導(dǎo)致的組間分布不均對(duì)結(jié)果造成了一定的偏倚有關(guān)。SAE2與腫瘤的臨床分期以及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，提示SAE2的高表達(dá)可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲過程起著促進(jìn)的作用，其異常不僅提示著腫瘤的存在，同時(shí)還可能反映腫瘤發(fā)展、浸潤的程度，其可以預(yù)測結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移情況，與前述研究發(fā)現(xiàn)具有一致性。

在本研究單因素分析中，患者的生存時(shí)間與年齡、Dukes分期、TNM分期、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)核轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及SAE2在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平有關(guān)，與分化程度、病理類型、術(shù)后有無放化療等無關(guān)。通過建立Cox多元回歸模型分析得知年齡、TNM分期以及SAE2在腫瘤組織的表達(dá)水平是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SAE2是結(jié)腸癌患者生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素，且其表達(dá)與腫瘤Dukes分期、TNM分期浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，預(yù)示其在評(píng)估結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移情況、判斷預(yù)后存在潛在價(jià)值，可作為判斷結(jié)腸癌進(jìn)展情況以及生存預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物。

本研究屬于回顧性研究，結(jié)腸癌患者部分資料，如患者其他感染情況、手術(shù)方式和治療記錄等情況登記不完整，故未對(duì)其與結(jié)腸癌患者總體生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。另外，部分結(jié)腸癌患者的失訪也造成了一定的信息偏倚。

綜上所述，SAE2與結(jié)腸癌的發(fā)生、侵襲性以及預(yù)后密切相關(guān)，在結(jié)腸癌患者的診治中結(jié)合TNM分期加入SAE2的檢測，或許可使結(jié)腸癌診治更具有客觀性和個(gè)體化。