肌萎縮側(cè)索硬化癥小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)CaMKII-α減少而CAMKII-β增多

蔣欣 ，管英俊，陳燕春，劉金夢(mèng) ，周風(fēng)華，王巧真，張皓云

(濰坊醫(yī)學(xué)院，1臨床醫(yī)學(xué)院，2神經(jīng)疾病與再生修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，濰坊261053)

肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一種以運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損害為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明[1]。錯(cuò)誤折疊的超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）累積所造成的氧化應(yīng)激異常及神經(jīng)毒性是ALS發(fā)病的重要原因之一[2]。除了運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)病變外，部分ALS患者也出現(xiàn)認(rèn)知障礙和進(jìn)行性海馬病理學(xué)改變[3]。

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase-II, CaMK II）是一種多功能蛋白激酶，主要由α和β亞基組成，它們?cè)谀X組織中的分布是非神經(jīng)組織的20～50倍，尤以海馬區(qū)更高[4]，但海馬CaMKII-α和CaMKII-β在ALS發(fā)病中的作用尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)選取模擬ALS的SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因模型小鼠，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測(cè)海馬中CaMKII-α和CaMKII-β的表達(dá)變化及其細(xì)胞類型，明確與ALS病變的關(guān)系，為從新的角度系統(tǒng)闡明ALS發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型（wild-type,WT）小鼠，購自Jackson實(shí)驗(yàn)室。按Chen等[5]方法進(jìn)行基因型鑒定，于發(fā)病早期（95d）、中期（108d）和晚期（122d）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

CaMKII-α兔多克隆抗體，Proteintech公司；CaMKII-β兔多克隆抗體， abcam公司；GAPDH兔單克隆抗體，GAPDH小鼠單克隆抗體，Proteintech Group 公司；Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，Jackson Immunoresearch實(shí)驗(yàn)公司；小鼠抗β-tubulinⅢ，R＆D 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TOYOBO公司。

3 CaMKII-α、CaMKII-β 免疫熒光染色

鼠腦冷凍切片PBS清洗3次，每次5 min，滴加10%山羊血清，37℃孵育40min，甩掉羊血清，分別滴加兔抗CaMKII-α（1:150）和小鼠抗β-tubulinⅢ（1:100）或者兔抗CaMKII-β（1:150）與小鼠抗β-tubulinⅢ（1:100）混合一抗，4℃孵育過夜。次日，PBS清洗5min，重復(fù)3次，滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠和Cy3標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗（終濃度為1:400），37℃避光孵育40min，滴加Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，37℃避光孵育15min，防淬滅熒光封片劑封片，對(duì)照組一抗用PBS代替。在熒光顯微鏡下觀察CaMKII-α、CaMKII-β 及 β-tubulin Ⅲ表達(dá)情況。

4 CaMKII-α、CaMKII-β mRNA RT-PCR 檢測(cè)

參照Chen等[5]方法進(jìn)行RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：CaMKII-α上游引物5＇-AGTCAGCCTGCATCGCCTAT-3＇，下游引物5＇-TGTGGAAGTGGACGATCTGC-3＇；CaMKII-β上游引物5＇-TACCGGCCATGAGTATGCAG-3＇，下游引物5＇-GGCGTACAATGTTGGAATGC-3＇；β-actin引物序列見Chen等[5]文章；2 × Flash Hot Start Master Mix 10μl，CaMKII-α 或 CaMKII-β 上下游引物各0.5μl，β-actin上游引物、下游引物各0.5μl，1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，組成 PCR 反應(yīng)體系。PCR儀中運(yùn)行程序:94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min后冷卻至4℃。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照保存圖像。

5 CaMKII-α、CaMKII-β Western Blot檢測(cè)

取ALS小鼠和WT小鼠海馬，加入裂解液冰上裂解30min，期間超聲破碎3次，4℃、12000 rpm/min離心15min，取其上清，檢測(cè)蛋白濃度。配制12% SDS-DAGE凝膠，電泳后孵育一抗GAPDH（1:2000）、CaMKII-α（1:800）、CaMKII-β（1:1000），4℃過夜。次日，常溫孵育羊抗小鼠或羊抗兔二抗（1:10000）2h，PBS清洗后滴加ECL孵育，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像，拍照保存圖像。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IPP6.0圖像分析軟件測(cè)量CaMKII-α、CaMKⅡ-β mRNA與β-actin mRNA陽性條帶、CaMKII-α、CaMKⅡ-β蛋白和GAPDH蛋白陽性條帶的光密度值，樣本中目的基因與管家基因mRNA和蛋白光密度值的比值來反映其含量變化。SPSS20.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示計(jì)量檢測(cè)結(jié)果。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CaMKII-α定位于海馬神經(jīng)元且在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)降低

免疫熒光分析顯示，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬中均可檢測(cè)到CaMKII-α免疫陽性細(xì)胞，分布在海馬DG區(qū)和CA區(qū)，并與β-tubulin Ⅲ標(biāo)記的神經(jīng)元共存。與WT小鼠相比，CaMKII-α在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA區(qū)和DG區(qū)細(xì)胞中免疫反應(yīng)性95d無明顯變化，108d和122d均明顯降低（圖1）。

RT-PCR檢測(cè)顯示，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬中均可見CaMKII-α mRNA陽性條帶。與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CaMKII-α mRNA的變化不明顯。

免疫印跡分析表明，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬均可檢測(cè)到明顯的CaMKII-α蛋白條帶。與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠CaMKII-α蛋白在95d無明顯變化，108d和122d均明顯降低（圖2）。

圖1 108d ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA區(qū)和DG區(qū)CaMKII-α表達(dá)變化及與β-tubulin III共定位的免疫熒光檢測(cè)。比例尺，50μmFig. 1 Immuno fluorescent examination for CaMKII-α expression change and co-localization with β-tubulin III in the CA and DG areas of the hippocampus in 108-day-old ALS mice. Scale bar, 50μm

圖2 ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中CaMKII-α表達(dá)變化的Western blot檢測(cè)（A）與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（B）。*，與WT小鼠比較，0.01＜P＜0.05；n = 4Fig. 2 Western blotting (A) and statistical analysis (B) for CaMKII-α expression change in the hippocampus of ALS mice. *, 0.01＜P＜0.05 vs WT mice;n = 4

2 CaMKII-β定位于海馬神經(jīng)元且在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)升高

免疫熒光染色顯示，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬中均可檢測(cè)到CaMKII-β免疫陽性細(xì)胞，分布在海馬DG區(qū)與CA區(qū)，與β-tubulin Ⅲ標(biāo)記的神經(jīng)元共存。與WT小鼠相比，CaMKII-β在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA區(qū)和DG區(qū)細(xì)胞中免疫反應(yīng)性95d無明顯變化，108d和122d明顯升高（圖3）。

圖3 108d ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA區(qū)和DG區(qū)CaMKII-β表達(dá)變化及與β-tubulin III共定位的免疫熒光檢測(cè)。比例尺，50μmFig. 3 Immuno fluorescent examination for CaMKII-β expression change and co-localization with β-tubulin III in the CA and DG areas of the hippocampus in 108-day-old ALS mice. Scale bar, 50μm

RT-PCR分析表明，在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬中均可見CaMKII-β mRNA陽性條帶。與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CaMKII-β mRNA的變化不明顯。

免疫印跡結(jié)果顯示，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠海馬均可檢測(cè)到明顯的CaMKII-β蛋白條帶。與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠CaMKII-β蛋白在95d呈升高的趨勢(shì)，108d和122d均明顯升高（圖4）。

討 論

一般認(rèn)為ALS是一種運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，但臨床上發(fā)現(xiàn)部分患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)外的癥狀，如癡呆、感覺障礙等，其確切發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。海馬是大腦內(nèi)與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)有關(guān)的結(jié)構(gòu)。臨床研究證明，ALS影響大腦中的皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，如丘腦、殼核、蒼白球和海馬體[6]。Westeneng等[7]發(fā)現(xiàn)，MRI顯示ALS患者海馬體的體積減少，表明海馬可能參與ALS神經(jīng)退行性過程。Quarta等[8]發(fā)現(xiàn)，SOD1-G93A突變的ALS小鼠海馬中間神經(jīng)元的減少會(huì)導(dǎo)致焦慮樣行為和選擇性學(xué)習(xí)障礙的發(fā)生。

大多數(shù)CaMKII全酶是α/β異源體，α/β為3:1，且二者比率具有可變性[4]。研究表明，阿爾茲海默癥發(fā)病過程中，神經(jīng)突觸CaMKII活性的降低發(fā)揮重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)以CaMKII為突破點(diǎn)，探究ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中CaMKII-α和CaMKII-β的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中CaMKII-α蛋白在發(fā)病過程中降低，而CaMKII-β蛋白則升高。提示CaMKII-α蛋白和CaMKII-β蛋白的異常表達(dá)與ALS發(fā)病相關(guān)。

Thiagarajan 等[4]發(fā)現(xiàn)，CaMKII-α 和 CaMKII-β的比率隨神經(jīng)元活動(dòng)性增加而增大，神經(jīng)元活動(dòng)性降低而減小。體內(nèi)神經(jīng)突觸根據(jù)對(duì)谷氨酸和γ-氨基丁酸敏感性的不同可分為興奮性神經(jīng)突觸和抑制性神經(jīng)突觸，興奮性突觸使突觸后膜去極化導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性升高，抑制性突觸通過陰離子門控通道使突觸后膜超極化導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性降低。研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)CaMKII的α亞單位只表達(dá)在興奮性中間神經(jīng)元，但是β亞單位除表達(dá)在興奮性神經(jīng)元外，也表達(dá)于抑制性中間神經(jīng)元[10]。研究證明，記憶形成過程取決于CaMKII-α與受體結(jié)合的持續(xù)作用，并未發(fā)現(xiàn)有CaMKII-β的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CaMKII-α蛋白在ALS發(fā)病過程中降低，CaMKII-β蛋白則升高，該結(jié)果與Thiagarajan等研究結(jié)果一致。CaMKII-α和CaMKII-β mRNA水平?jīng)]有發(fā)生改變，而蛋白水平有變化，推測(cè)這種現(xiàn)象可能是受到miRNA的調(diào)節(jié)所致。MiRNA是約22個(gè)核苷酸的小RNA，與許多mRNA上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)它們的降解并抑制它們的翻譯。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)mir-124可通過靶向調(diào)控ALS轉(zhuǎn)基因小鼠中的下游基因來調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，下游基因蛋白水平顯著改變，mRNA水平保持不變，表明ALS病變過程有miRNA的參與。Kocerha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠中mir-219具有負(fù)性調(diào)節(jié)CaMKII的作用。

圖4 ALS轉(zhuǎn)基因小鼠海馬中CaMKII- β表達(dá)變化的Western blot檢測(cè)（A）與統(tǒng)計(jì)學(xué)分分析（B）。*，與WT小鼠比較，0.01＜P＜0.05；n= 4Fig. 4 Western blotting (A) and statistical analysis (B) for CaMKII- β expression change in the hippocampus of ALS mice. *, 0.01＜P＜0.05 vs WT mice;n = 4

CaMKII作為Wnt非經(jīng)典通路下游重要信號(hào)分子，參與調(diào)控Wnt信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路在短期調(diào)控海馬神經(jīng)元活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，多種Wnt信號(hào)分子在ALS轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中表達(dá)異常[14,15]。CaMKII表達(dá)變化與Wnt信號(hào)通路的關(guān)系及其在ALS發(fā)病中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。