角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病中作用的研究進(jìn)展①

黃海勇 黃功華 劉新光

(廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所，廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,東莞 523808)

銀屑病是慢性易復(fù)發(fā)炎癥性皮膚病,可分為尋常型、斑點(diǎn)型、間質(zhì)型、膿胞型、紅皮病型，臨床癥狀為界限清楚的紅色斑點(diǎn)、丘疹、皮膚褶皺、銀白色樣鱗屑，病理變化為角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)高度異常增殖、角化不全、棘皮增厚、伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生，在世界范圍內(nèi)的患病率大約為2%[1-3]。銀屑病由表皮和真皮中不同的效應(yīng)白細(xì)胞亞群的浸潤(rùn)引起，涉及固有性和適應(yīng)性免疫過程。關(guān)于KC在銀屑病中的作用尚存爭(zhēng)議，研究認(rèn)為KC的過度增殖和異常分化是免疫系統(tǒng)激活誘導(dǎo)的次要現(xiàn)象，主要基于免疫功能紊亂的樹突細(xì)胞(dendritic Cell,DC)和Th17細(xì)胞，而銀屑病不能被認(rèn)為是單獨(dú)的DC和Th17細(xì)胞依賴性免疫疾病。健康的皮膚為機(jī)體提供有效的物理和免疫保護(hù)屏障，最先接觸病原體而快速感知環(huán)境信號(hào)變化，并對(duì)不同的刺激信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，維持皮膚生理功能的動(dòng)態(tài)平衡。KC在銀屑病早期觸發(fā)致病事件及維持疾病慢性期方面起重要作用,在觸發(fā)因子(如皮膚創(chuàng)傷、病原體或藥物等)激活后打破皮膚生理穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生細(xì)胞因子(包括抗菌肽、IL-1家族和趨化因子等)成為先天免疫介質(zhì)來源，皮膚免疫微環(huán)境改變并通過募集DC、中性粒細(xì)胞、Th17細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等引發(fā)適應(yīng)性免疫[4]。KC和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的相互作用進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，并維持疾病慢性期。此外，由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)通路的激活和KC內(nèi)在遺傳信息改變，可能是造成增殖和分化過程不平衡及在銀屑病皮膚中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的原因。目前銀屑病研究的模型主要包括自發(fā)性小鼠模型、基因動(dòng)物模型、異體移植動(dòng)物模型和人工誘導(dǎo)的動(dòng)物模型[5]。盡管銀屑病既往的研究取得了重大進(jìn)展，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究KC在銀屑病的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床治療和預(yù)后、提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。

1 KC在銀屑病中的屏障功能

1.1磷脂酶C同工酶PLCδ1(phospholipase C isozymes δ1,PLCδ1)異常破壞KC屏障完整性 磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是磷脂酰肌醇信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，活化的PLC能水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(Phosphatidylinositol biphosphate,PIP2)產(chǎn)生重要的第二信使二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)。IP3是細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度梯度的主要調(diào)節(jié)因子。PLC調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的生理途徑，并調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)這些途徑中的其他酶作用，控制細(xì)胞生理學(xué)行為[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病的病損皮膚中PLC的同工酶活性PLCδ1下降[7]。在咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病模型中，敲除PLCδ1不但可影響KC的屏障功能，并且可破壞KC之間的緊密連接。體外研究證明，抑制PLCδ1表達(dá)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道的Ca2+釋放不足導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度降低，Ca2+誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear translocation of the transcription factor,NFAT)活化不足，使與屏障功能相關(guān)的下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下降。另外，PLCδ1被抑制后p38的磷酸化水平升高，從而抑制RhoA信號(hào)通路，在PLCδ1敲除的細(xì)胞中通過p38抑制劑抑制p38磷酸化活性，恢復(fù)絲聚蛋白(Filaggrin)和緊密連接蛋白1(zonula occludens-1 protein,ZO-1)水平。表明在銀屑病病損皮膚中，PLCδ1表達(dá)降低導(dǎo)致p38磷酸化水平升高可損傷KC屏障功能[8]。

1.2CARD14激活NF-κB信號(hào)通路影響KC屏障功能 半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域封閉蛋白質(zhì)(caspase recruitment domain-containing protein,CARD)是氨基酸序列極度保守的細(xì)胞支架蛋白，發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)功能，包括免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)、組織穩(wěn)態(tài)和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[9]。人CARD蛋白分別由位于7,17和22號(hào)染色體上3個(gè)保守基因編碼。CARD家族的表達(dá)具有組織差異性，CARD14主要在KC中表達(dá)。CARD14：BCL10：MALT1(CBM)復(fù)合物是維持固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要信號(hào)節(jié)點(diǎn)，主要通過識(shí)別上游病原體相關(guān)模式分子(如KC上表達(dá)的TLR家族成員)激活發(fā)揮效應(yīng)，發(fā)揮在表皮屏障的固有免疫防御作用[10，11]。細(xì)胞接受刺激后，位于卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)和突觸前密度蛋白(post-synaptic density protein,PDZ)之間的抑制性接頭區(qū)域的CARD14通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)的絲氨酸殘基的磷酸化去除抑制，從而促進(jìn)CBM復(fù)合物形成，最終導(dǎo)致IκB激酶復(fù)合物(IκB kinase complex ,IKK)的募集和NF-κB活化[12，13]。CARD14通過募集BCL10和MALT1促進(jìn)NF-κB和MAPK信號(hào)通路激活，從而上調(diào)編碼IL-36γ、IL-8、CCL20和抗菌肽等促炎基因，刺激DC活化并分泌IL-23、IL-1β誘導(dǎo)naive T 細(xì)胞向Th17分化加劇炎癥反應(yīng)[14]。小鼠CARD14基因中第138位谷氨酸突變后可引起自發(fā)性銀屑病，包括特征性的臨床表現(xiàn)和病理變化，皮膚出現(xiàn)類似于銀屑病的典型細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽基因的上調(diào)及絲聚蛋白和連接蛋白表達(dá)下降[15]。因此，CARD14是銀屑病的易感基因并對(duì)銀屑病的預(yù)測(cè)和預(yù)后具有重要意義。

2 KC的增殖和分化

2.1視黃醇結(jié)合蛋白Ⅰ(cellular retinol binding protein Ⅰ,CRBPⅠ) 視黃醇(維生素A)及其代謝產(chǎn)物視黃醛和全反式維甲酸是細(xì)胞活動(dòng)的天然調(diào)節(jié)劑，介導(dǎo)皮膚細(xì)胞調(diào)節(jié)功能[16]。視黃醇水溶性差，胞質(zhì)內(nèi)CRBPⅠ有助于細(xì)胞攝取視黃醇，保護(hù)視黃醇免受與酶的非特異性相互作用，將全反式維甲酸遞送至核受體(CRABP2，F(xiàn)ABP5)，維持全反式視甲酸在細(xì)胞內(nèi)的功能穩(wěn)定，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和分化進(jìn)程[17]。銀屑病患者的病損皮膚側(cè)CRBPⅠ異常升高，IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中，CRBPⅠ基因敲除小鼠的發(fā)病程度比野生型小鼠更嚴(yán)重。在人表皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)CRBPⅠ，維持細(xì)胞增殖NF-κB和AKT信號(hào)通路、顯著激活，與視黃醇在細(xì)胞內(nèi)過度累積導(dǎo)致細(xì)胞功能異常相關(guān)。炎癥因子IL-2和IL-6誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞活化，并維持輔助性Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡，在人表皮細(xì)胞中過表達(dá)CRBPⅠ可明顯降低IL-2和IL-6水平[18]。病損皮膚中高表達(dá)的CRBPⅠ同樣能誘導(dǎo)早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因1(early growth response gene 1，EGR1)表達(dá)[19]。KC中EGR1通過抑制細(xì)胞分裂周期基因25A(cell division cycle 25 A,CDC25A)表達(dá)和降低細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinas 2,CDK2)上的Tyr15/Thr14去磷酸化水平減少CDK2 /細(xì)胞周期蛋白E復(fù)合物激活，使細(xì)胞周期停滯在G1期，這可能是銀屑病CRBPⅠ介導(dǎo)EGR1抑制細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制[20]。

2.2Wnt5a/β-Catenin信號(hào) Wnt5a參與KC增殖的整個(gè)過程，與正常皮膚相比，Wnt5a及其7 次跨膜蛋白卷曲受體Frizzled2/5在銀屑病病損皮膚中高表達(dá)。同時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3降低而抗凋亡相關(guān)的Bcl-2、生存素相應(yīng)升高。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a可通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑或非經(jīng)典的PKC/鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ途徑影響KC增殖凋亡，胞質(zhì)中的β-catenin在GSK3β/Axin/APC蛋白復(fù)合物作用下無活性[21]。Wnt5a信號(hào)激活使復(fù)合物中的GSK3β磷酸化水平升高，對(duì)β-catenin的抑制能力下降，導(dǎo)致β-catenin轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核調(diào)節(jié)下游Cyclin D1、C-myc活性，調(diào)節(jié)KC增殖。敲除Wnt5a可下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)的標(biāo)志如PCNA和KI67的水平。同時(shí)，病損皮膚中的IL-36γ借助Wnt/β-catenin信號(hào)抑制KC分化并誘發(fā)炎癥反應(yīng)[22]。

2.3PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路 銀屑病患者中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)水平升高，多種炎癥因子如IL-6、IL-12、CXCL8、VEGF可被mTOR信號(hào)通路激活分泌[23]。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是真核細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和新陳代謝。銀屑病中，KC在細(xì)胞外信號(hào)作用下，PI3K在配體結(jié)合酪氨酸激酶受體或G蛋白偶聯(lián)受體后活化，PI3K與胞膜的PIP3協(xié)同作用并充當(dāng)?shù)诙攀鼓技疉KT和磷酸肌醇依賴性激酶(phosphoinositol-dependent-kinase 1,PDK1)到膜上，信號(hào)轉(zhuǎn)換后，mTORC1通過磷酸化真核起始因子4E結(jié)合蛋白 (eukaryotic translation initiation factor 4E binding proteins,4EBP)或核糖體S6蛋白激酶1/2(ribosomal S6 protein kinases,S6K1/2)，促進(jìn)mRNA釋放并增加與翻譯起始因子的結(jié)合形成活化的翻譯起始復(fù)合物?；罨腟6K通過抑制真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase,eEF2K)活性，使蛋白翻譯延伸。mTORC1控制蛋白質(zhì)生物合成速率、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖必需的大分子合成[24]。KC中的mTOR信號(hào)通路被永久激活，使表皮呈現(xiàn)高度異常增殖和成熟分化功能被抑制銀屑病。高度活化的PI3K/AKT/mTORC1可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核自噬功能，在角質(zhì)形成細(xì)胞向成熟的角質(zhì)細(xì)胞分化過程中，高mTORC1活性抑制核降解導(dǎo)致角化不全[25]。mTOR是雷帕霉素的靶蛋白，已有研究表明雷帕霉素在銀屑病中有抗增殖和免疫抑制作用，雷帕霉素處理IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的皮膚明顯病情明顯改善，表明局部應(yīng)用mTOR抑制劑可能成功治療銀屑病[26]。KC的增殖分化平衡在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，諸多因素參與這一過程，尋找銀屑病中與KC更具特異性的相關(guān)信號(hào)通路，可為臨床治療提供理論依據(jù)。

3 銀屑病中KC與免疫細(xì)胞的相互作用

3.1銀屑病早期KC參與固有免疫反應(yīng) 在銀屑病的初始階段，KC參與DC、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的募集和活化過程，早期KC在外界應(yīng)激、創(chuàng)傷、感染、藥物的刺激下產(chǎn)生TGF-β1、IL-1、IL-6和抗菌肽SA100家族等炎癥因子,使未成熟的DC活化并誘導(dǎo)naive T 細(xì)胞向不同效應(yīng)T細(xì)胞亞群分化。報(bào)道顯示，KC在受到外界刺激后，產(chǎn)生抗菌肽LL-37并與損傷細(xì)胞釋放的核酸形成復(fù)合物，誘導(dǎo)DC表達(dá)IFN-γ、IL-6和TNF-α[27]。KC的LL-37通過旁分泌和自分泌通路調(diào)節(jié)自身IL-1家族細(xì)胞因子表達(dá)(包括IL-36γ)[28]。此外，KC中LL-37通過IL-36R信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)CXCL8和CXCL1等趨化因子表達(dá)，加速病損皮膚中中性粒細(xì)胞的募集。LL-37在銀屑病KC中誘導(dǎo)CXCL10和CCL20的表達(dá)，可能是DC和Th17在銀屑病后期固有性免疫的原因之一。

3.2銀屑病慢性期KC誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫 銀屑病中DC激活是驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞分化的決定因素，DC功能的成熟取決于早期先天免疫期期間由KC釋放的介質(zhì)，其中IL-36、IL-1家族可影響DC功能，未成熟的DC在受到這些細(xì)胞因子的刺激下活化，并產(chǎn)生IL-12，促使naive T cell 向Th1分化，Th1分泌IFN-γ、TNF-α引發(fā)細(xì)胞免疫[29]。研究發(fā)現(xiàn)，活化的DC同樣可產(chǎn)生和IL-12具有共同亞基P40的IL-23，IL-23誘導(dǎo)naive T 細(xì)胞向Th17分化，Th17細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22等。KC表面的IL-17受體IL-17R接受刺激信號(hào)后，表達(dá)多種趨化因子，包括CCL20、CCL1、CCL2、CCL3、CCL5、CCL8。CCL20可直接募集CCR6+細(xì)胞到病損皮膚，并提高β-防御素、S100A家族水平[30]。KC釋放的IL-18與IL-12協(xié)同作用，通過在銀屑病損傷皮膚中誘導(dǎo)IFN-γ而促發(fā)Th1應(yīng)答[31]。γδT細(xì)胞浸潤(rùn)可在IL-18存在下通過IL-23信號(hào)軸產(chǎn)生IL-17[32]。KC本身作為銀屑病發(fā)病的起始因素感受外界刺激，產(chǎn)生與正常皮膚不同的細(xì)胞因子和趨化因子。病損皮膚KC接受DC和Th17細(xì)胞的刺激信號(hào)并放大DC-Th17的病理效應(yīng)，形成正反饋通路使KC增殖分化失去控制導(dǎo)致過度增生并分泌炎癥因子。作用于IL-17的藥物正處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)，包括IL-17A單克隆抗體Secukinumab、Ixekizumab和IL-17RA單克隆抗體Brodalumab，隨著研究的深入，更多藥物將被用于銀屑病臨床治療。

4 總結(jié)與展望

銀屑病的發(fā)生是多因素、多信號(hào)、多細(xì)胞參與的復(fù)雜調(diào)控過程。KC是炎癥反應(yīng)始動(dòng)者，與其他免疫細(xì)胞相互作用產(chǎn)生炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路影響自身增殖分化及皮膚局部炎癥反應(yīng)。因此KC穩(wěn)態(tài)被打破將誘發(fā)疾病。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)等方法使課題組對(duì)銀屑病中KC的作用機(jī)理有了更為深入了解。雖然部分針對(duì)KC作為銀屑病治療靶標(biāo)的生物學(xué)方法已取得初步成效，但銀屑病中KC細(xì)胞的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，以期發(fā)現(xiàn)銀屑病更有效的治療方法。